重症监护病房碳青霉烯类抗生素耐药鲍曼不动杆菌耐药机制及同源性分析

毛 璞， 邱桂霞， 叶 丹， 刘晓青， 黎毅敏，

重症监护病房碳青霉烯类抗生素耐药鲍曼不动杆菌耐药机制及同源性分析

毛 璞， 邱桂霞＊， 叶 丹， 刘晓青＊＊， 黎毅敏＊，＊＊

目的分析耐碳青霉烯类抗生素鲍曼不动杆菌基因型，进行同源性分析，探讨碳青霉烯类抗生素耐药率升高的原因。方法应用WHONET 5.0分析广州医学院第一附属医院重症监护病房（ICU）分离的鲍曼不动杆菌耐药率变化。收集2008年1月至2009年12月ICU碳青霉烯类抗生素耐药鲍曼不动杆菌35株，应用VITEK-2全自动细菌鉴定仪进行菌株鉴定，采用K-B纸片扩散法测定15种抗菌药物的敏感性，PCR检测金属β内酰胺酶及碳青霉烯酶OXA基因，脉冲场凝胶电泳（PFGE）分析同源性。结果该院分离的鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗生素的耐药率显著增加，对美罗培南的耐药率从10.8%升高到62.3%，对亚胺培南的耐药率从13.5%升高到58.8%。PFGE分析存在8个克隆；blaOXA-51、blaOXA-23、blaOXA-58阳性的分别为33株（94.3%）、20株（57.1%）和6株（17.1%）。ISAba1相关blaOXA-23是碳青霉烯酶主要的存在形式。未检测到金属β内酰胺酶。结论该院ICU分离的鲍曼不动杆菌OXA-23型碳青霉烯酶基因检出率最高，并存在交叉感染的情况，应引起临床重视。

鲍曼不动杆菌； 碳青霉烯酶； 脉冲场凝胶电泳

鲍曼不动杆菌已成为引起医院感染的最主要的细菌之一［1-2］。对产超广谱β内酰胺酶（extendedspectrumβ-lactamases，ESBLs）、Amp Cβ内酰胺酶（AmpCβ-lactamases，AmpC酶）的鲍曼不动杆菌引起的重症感染，碳青霉烯类抗生素是最后一道防线。碳青霉烯类抗生素耐药的分子机制主要由于外源性获得碳青霉烯酶，主要分为B类和D类酶。B类酶又 称 为 金 属 β 内 酰 胺 酶 （metallo-β-lactamases，MBLs），目前鲍曼不动杆菌中已被鉴别出来的获得性MBLs有IMP、VIM型酶等。D类酶为苯唑西林酶（OXA型酶），在鲍曼不动杆菌中常见有blaOXA-23、blaOXA-24、blaOXA-51、blaOXA-58［3］。此 外，常 见插入序列ISAba1位于OXA基因前增强其表达［4］。

2008—2009年间，我院重症监护病房（ICU）分离的鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗生素耐药率明显升高。本研究主要通过对 MBLs、OXA、ISAba1等基因的检测，分析该菌对碳青霉烯类抗生素耐药的变化，从而探讨其对碳青霉烯类抗生素耐药机制。

材料与方法

一、材料

（一）菌株来源 2008年1月至2009年12月，我院ICU住院患者痰标本临床分离株，非重复临床分离的碳青霉烯类抗生素耐药鲍曼不动杆菌（carbapenem-resistantAcinetobacterbaumannii，CRAB）35株。

（二）仪器与试剂 PCR扩增仪（Bio-rad公司1000），凝胶成像系统（Bio-rad公司）。所用引物均由上海英骏生物技术有限公司合成。PCR试剂购自大连宝生物工程有限公司。New England Biolabs限制性内切酶ApaⅠ。

二、方法

（一）菌株鉴定及药敏试验 使用VITEK-2微生物自动检测仪鉴定菌种。采用K-B纸片扩散法测定鲍曼不动杆菌对哌拉西林、哌拉西林-他唑巴坦、替卡西林-克拉维酸、头孢他啶、头孢噻肟、头孢吡肟、头孢曲松、亚胺培南、美罗培南、阿米卡星、庆大霉素、米诺环素、环丙沙星、左氧氟沙星和甲氧苄啶-磺胺甲口恶唑等15种抗菌药物的敏感性，以大肠埃希菌ATCC 25922、铜绿假单胞菌ATCC 27853和金葡菌ATCC 25923为质控菌株，结果判定参照CLSI 2009年标准。

（二）脉冲场凝胶电泳（PFGE） 分离株接种于LB液体培养基中，37℃培养过液。离心收集40 μLA540的菌液，20μL 1×TE重悬，加入等体积的2%cleancut agarose（Bio-rad，USA）。立即混匀后加入模具，制成胶块。将胶块放入300μL的细胞裂解液（100 mmol／L Tris、100 mmol／L EDTA），加入20 mg／m L的蛋白酶K 5μL 50℃浴过夜。去掉细胞裂解液，加入800μL 1×TE洗3次，每次1 h。0.1×TE 800μL洗1 h。继续酶切或放4℃保存备用。每块小胶加50 u ApaⅠ（NEB，USA）内切酶，25℃过夜。CHEF-DR Ⅲ脉冲场电泳仪（Bio-rad，USA），0.5×TBE，1%Pulsed Field Certified Agarose（Bio-rad），14℃，6V／cm，角度变换120°，线性，转换时间为0.5～20 s，时间20 h。电流结束后，EB染色后成像。

应用Bio Numerics软件行图像分析，选择UPGMA（unweighted pair group method using arithmetic averages）方法，条带位置差异容许度1%，优化值0.5%，相似度≥80%为同一亚型，代表同一克隆株；＜80%者为不同的基因型，代表不同的克隆株［5］。

（三）PCR检测 应用煮沸法粗制细菌DNA模版。PCR 检 测blaIMP-1、blaIMP-2、blaVIM-1、blaVIM-2、blaOXA-23、blaOXA-24、blaOXA-51、blaOXA-58基 因，各 基 因 引物序列、目的产物长度和退火温度见表1。PCR体系总体积50μL，10×缓冲液 5μL，d NTPs 200μmol／L，上下游引物各400 nmol／L，Taq聚合酶1.25 u，DNA模板1μL。扩增产物取5μL进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，90 V，30 min。EB染色后成像。PCR产物送上海英骏生物技术有限公司测序。

结 果

一、药敏试验结果

应用WHONET5.4分析2008年1月至2009年12月ICU分离鲍曼不动杆菌的耐药率，碳青霉烯类抗生素的耐药率显著增加，对美罗培南的耐药率从10.8%增加至62.3%，对亚胺培南的耐药率从13.5%增加至58.8%（图1）。

二、碳青霉烯酶基因及插入序列检测

2008年1月至2009年12月，我院重症监护病房住院患者痰标本临床分离非重复CRAB共51株，由于属于回顾性分析，将其中随机冻存的35株进一步分析。

在35 株 CRAB 中，blaOXA-51、blaOXA-23、blaOXA-58阳性的分别为33株（94.3%）、20株（57.1%）和6株（17.1%）。同时携带blaOXA-51和blaOXA-23菌株有20株（57.1%）；同时携带blaOXA-51和blaOXA-58的菌株有 6 株 （17.14%）。 未 检 测 出blaOXA-24、blaIMP-1、blaIMP-2、blaVIM-1、blaVIM-2基 因。携 带 有blaOXA-23的 菌株上游检测均检测到插入序列ISAba1，5株菌株blaOXA-51上游检测到ISAba1，1株菌株blaOXA-58上游检测到ISAba1。

表1 碳青霉烯酶基因及插入序列PCR引物Table1.Primers and insert sequences used in polymerase chain reaction to detect carbapenemase genes

图1 2008年至2009年鲍曼不动杆菌耐药率变化FIG.1.Changing pattern of antibiotic resistance in the A.baumannii strains isolated during the period from 2008 through 2009

三、PFGE同源性分析

采用PFGE对CRAB进行同源性分析，结果显示共存在8个克隆，克隆A包括2110、1566菌株，克隆B包括4006、3038菌株，克隆C包括4128、2544、4358菌株，克隆 D包括3605、2772、3334，克隆 E包括3693、3325，克隆F包括685、4492，克隆G包括4026、4405，克隆H包括433、1239（见图2）。上述结果提示在研究期间存在6次交叉感染（分别涉及2例患者）；存在2次小规模流行，分别涉及3例患者。51.4%（18／35）分离出CRAB的患者发生了交叉感染。

讨 论

近年来，鲍曼不动杆菌在全球的扩散引起了极大的关注。自1985年碳青霉烯类抗生素应用于临床，该菌对其耐药率逐年增加。对CRAB大多数为多重耐药菌，因此对住院患者造成的威胁也逐年增大。另由于ICU患者病情重，侵袭性操作多，成为多重耐药细菌滋生传播的主要场所［6］。因此，本研究对ICU临床分离CRAB进行耐药趋势、同源性及耐药分子特征分析，研究鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗生素耐药的变化与 MBLs、OXA、ISAba1的相关性，探讨鲍曼不动杆菌迅速扩散的原因。

图2 PFGE图谱及系统树状图FIG.2.PFGE profiles of Apa-I digested genomic DNA of 35 carbapenem-resistant A.baumannii strains isolated from ICU patients

OXA-23是鲍曼不动杆菌中最早报道的OXA型碳青霉烯酶［7］。本研究结果显示本组CRAB OXA-23的携带率为57.1%，为主要分布的碳青霉烯酶，此阳性率明显低于其他医院或地区的报道；本研究中OXA-58的阳性率为17.1%，却明显高于其他医院或地区的报道。沈萍等［8］报道2005年浙江地区CRAB的OXA-23阳性率已经高达94.15%（322／342），无 OXA-58的检测出；四川大学华西医院2006至2009年ICU CRAB的OXA-23阳性率已经高达 99.0% （98／97），OXA-58 阳性率 仅 为1%［9］；全国12所三级甲等医院2007年7月至2008年6月 CRAB 的 OXA-23阳性率为80.4%（78／97），OXA-58阳性率仅为2.1%［10］。此期间内广州地区相关研究鲜有报道。因此我们推测可能由于地域、科室等不同，存在不同的流行菌株，造成了OXA-23、OXA-58阳性率的差异。尽管 OXA-23、OXA-58阳性率在上述报道中各有高低，但OXA-23均为鲍曼不动杆菌中主要分布碳青霉烯酶的型。

35株CRAB中33株菌携带OXA-51基因，仅有5株菌的上游存在ISAba1，6株OXA-58阳性菌株中1株菌上游检测到ISAba1，20株OXA-23阳性菌株上游均检测到ISAba1。上述结果表明在我院分离的CRAB中ISAba1主要位于OXA-23的上游。

同时携带OXA-51和OXA-23的20株菌中，ISAba1均位于OXA-23的上游；同时携带blaOXA-51和blaOXA-58的菌株有6株（17.1%），仅有1株菌的OXA-58上游存在ISAba1，其余菌株blaOXA-51和blaOXA-58上游均未检测到ISAba1。当OXA-23与 OXA-51或 OXA-58同时存在，ISAba1倾向插入OXA-23的上游。因此，我们推测，菌株一旦外源获得OXA-23基因，ISAba1从其他位置转移优先插入至OXA-23的上游。

本研究中，2株菌没有检测出鲍曼不动杆菌固有耐药基因OXA-51，我们推测这2株菌可能不是鲍曼不动杆菌，而属于其他不动杆菌；或可能OXA-51的基因发生变异，PCR无法检测。

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The resistance mechanism and molecular epidemiology of carbapenem-resistantAcinetobacterbaumanniiin an intensive care unit

MAOPu，QIUGuixia，YEDan，LIUXiaoqing，LIYimin. （DepartmentofInfectionControl，The FirstAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalCollege，Guangzhou510120，China）

ObjectiveTo analyze the carbapenemase genotypes and homogeneity among the isolates ofAcinetobacterbaumannii，and identify the factors contributing to the increasing carbapenem resistance.MethodsWHONET 5.0 software was used to analyze the changing prevalence of antibiotic resistance.Thirty-five carbapenem-resistantA.baumanniiisolates were collected from an Intensive Care Unit between 2008 and 2009.All strains were identified by VITEK-2 and tested by Kirby-Bauer disk diffusion test.The carbapenemases and their relationship with ISAba1，metallo-β-lactamases genes were analyzed by PCR.Genotyping were conducted by pulsed-field gel electrophoresis.ResultsThe prevalence of meropenem-resistant strains increased rapidly from 10.8%to 62.3%，and imipenem-resistant strains increased from 13.5%to 58.8%.Eight clones were identified in the 35A.baumanniistrains.TheblaOXA-51，blaOXA-23，andblaOXA-58genes were identified in 94.29% （33／35），57.14% （20／35）and 17.14% （6／35）of theseA.baumanniistrains，respectively.ISAba1-associatedblaOXA-23genes were prevalent in carbapenem-resistantA.baumannii.No metallo-β-lactamases gene was identified.ConclusionsOXA-type carbapenemases（mainly OXA-23）play an important role in carbapenem-resistantA.baumannii.Attention should be paid to the cross-infection and prevalence of carbapenem-resistantA.baumanniiin ICU.

Acinetobacterbaumannii； carbapenemase； pulsed-field gel electrophoresis

黎毅敏，E-mail：lymin98＠yahoo.com。

R978.12；R378

A

1009-7708（2012）06-0449-04

广州市教育局创新团队科研基金（B94117）；广州市科技计划项目（2010J-E171）。

广州医学院第一附属医院医院感染管理部，广州 510120；＊呼吸疾病国家重点实验室 广州呼吸疾病研究所；＊＊重症医学科。

毛璞（1981—），女，助理研究员，博士，主要从事医院感染控制与细菌耐药研究。

2012-06-01

·论著·