非肽类肾素抑制剂的研究进展

石 辰， 孙晓伟， 孙宏斌

(中国药科大学新药研究中心，江苏南京210009)

肾素是由肾脏分泌的一种高选择性的天冬氨酸蛋白酶，是肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)的重要组成部分，而RAAS在维持血管功能和正常血压中起着重要作用。经肾素的作用，血管紧张素原的N端被切断，从而生成具有活性的十肽——血管紧张素Ⅰ(Ang I)，继而经血管紧张素转化酶(ACE)的作用生成八肽的血管紧张素Ⅱ(Ang II)，后者与血管紧张素受体(AT1)结合，导致血管收缩，引起高血压。血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)和血管紧张素受体阻断剂(ARB)即通过阻断RAAS起作用，这两类抗高血压药物已在临床上使用多年，其安全性和有效性均获得认可，但仍有一定局限性，如两者对肾素的释放具有负反馈调节作用，在某些情况下不能有效地降低血浆肾素活性(PRA)，其中，ACEI还会因影响缓激肽和P物质的降解而导致咳嗽、血管性水肿等不良反应，且长期应用时存在“Ang II逃逸”现象，使糜蛋白酶介导的Ang II生成的旁路途径反馈性激活。直接肾素抑制剂(DRI)对肾素具有高选择性，作用于RAAS通路的起始点，与ACEI和ARB的作用机制不同，故其在疗效和副作用方面亦与这两类作用于RAAS抗高血压药物有所不同［1-3］。

肾素历来被药物化学家视为一个富有挑战性的靶点，以其为靶点的药物研发始于20世纪60年代，随后20年的大量研究集中在拟肽类抑制剂上并发现了一些活性化合物，但这些化合物由于分子质量大、口服生物利用度低、体内清除速率快、生产费用高等因素而不具有成药性［4］。到20世纪90年代中期，大量非肽类肾素抑制剂相继被报道，直至2007年，Novartis公司开发的抗高血压药阿利克仑(aliskiren)成为首个上市的DRI［5］。至此，世界各大制药公司，包括诺华(Novartis)、Speedel、罗氏(Roche)、辉瑞(Pfizer)、默克(Merck)、Actelion、葛兰素史克(GSK)、Vitae、赛诺菲(Sanofi)和武田(Takeda)等公司都相继开启了各自的相关药物研发项目，且有一些公司组成战略联盟(如罗氏与Speedel、默克与Actelion、葛兰素史克与Vitae)共同研发非肽类肾素抑制剂，其中一些活性较好的化合物已上市或进入Ⅰ、Ⅱ期临床试验(见表1)［6-7］。阿利克仑的成功很大程度上得益于计算机辅助药物设计，因此，目前在此类药物的研发中大多采用了对接、定量构效关系(QSAR)、药效团模型等基于结构的药物设计工具，并得到了一些有较好体外活性的化合物［7-11］。本文对各种结构类型的非肽类肾素抑制剂的结构改造、构效关系和临床应用研究进展作一综述。

表1 非肽类肾素抑制剂的研发情况Table1 The research and development of nonpeptide renin inhibitors

1 阿利克仑及其类似物

阿利克仑(1)化学名为(2S，4S，5S，7S)-5-氨基-N-(2-氨基甲酰基-2-甲基丙基)-4-羟基-2-异丙基-7-［4-甲氧基-3-(3-甲氧基丙氧基)苄基］-8-甲基壬酰胺。2007年先后在美国FDA和欧盟获准上市，2009年进入日本市场，2010年在中国上市，商品名为锐思力。该药是首个新型、高效、可口服的人肾素非肽类抑制剂，体外实验测得其对肾素的IC50为0.6 nmoL·L-1，而经口服后的生物利用度为3%［5］。目前，有关阿利克仑的临床研究项目达100多个，内容除降压作用外还涉及心脏保护、抗动脉粥样硬化及肾脏保护等［12］。

然而，阿利克仑存在一些不容忽视的副作用和不良反应。2011年5月的一项研究报告指出，与ACEI相似，阿利克仑可导致血管性水肿［13］。2011年12月20日，Novartis公司终止了一项与使用阿利克仑有关的临床研究，原因是在此项以合并2型糖尿病与肾功能损害且有较高的心血管及肾脏事件风险的患者为受试对象的实验中发现，阿利克仑与ACEI或ARB等心血管药物联用会增加用药者发生中风、肾脏并发症、高钾血症以及低血压的风险。

为寻找副作用小且疗效更好的非肽类肾素抑制剂，研究人员对阿利克仑进行了一系列的结构改造。如Yamauchi等［14］对阿利克仑的2个异丙基结构进行改造，得到了一类具有苯甲酰胺或苯甲磺酰胺结构的肾素抑制剂。其中，具苯甲酰胺结构的化合物2对肾素的体外IC50为2 nmoL·L-1，但给缺钠模型的绒猴经口使用本品(3 mg·kg-1)后，血压仅出现短暂性下降，苯甲磺酰胺类化合物的活性则不及苯甲酰胺类化合物的1%。此外，当该类化合物的苯环上无甲氧基丙氧基取代时，会因与肾素的亲和力降低而导致活性下降。

笔者所在课题组合成了一系列可靶向肾素S3'位点的1，3-丙二胺类阿利克仑类似物，采用肾素荧光共振能量转移法进行的体外抑制活性试验显示:这些化合物对肾素的IC50为0.4～5 nmoL·L-1，其中以磺酰胺、二甲基脲、氨基磺酰基等作为酰胺电子等排体插入得到的化合物活性显著增加，如化合物3对肾素的IC50为0.4 nmoL·L-1，活性为阿利克仑(IC50=2.21 nmoL·L-1)的5倍。构效关系研究表明:末端酰胺键羰基上以短疏水链取代的化合物活性较长疏水链取代的化合物的活性差，阿利克仑的活性则介于两者之间。

此外，课题组还合成了一个末端为三氮唑结构的化合物(4)，其对肾素的体外IC50达0.2 nmoL· L-1，活性为阿利克仑的10倍。推测其活性高的原因是其末端芳香环结构与肾素中Tyr75上的苯环形成π-π堆积作用，增强了其与肾素的亲和力。该化合物有望被进一步开发为肾素抑制剂药物，后续的相关研究尚在进行之中［15］。

2 4-芳基哌啶类肾素抑制剂

4-芳基哌啶类肾素抑制剂最初的典型化合物是瑞士罗氏公司研制的RO-66-1168(5)，其虽然对肾素的体外抑制活性强(IC50=0.039 nmoL·L-1)，但终因药动学性质差，止步于临床前试验。2002年初，罗氏公司将其全部肾素抑制剂研究项目独家授权于Speedel公司，后者将该项目中的化合物命名为 SPP-600系列，其中研发进度最快的为SPP-635［6］。

SPP-635的确切结构尚未公布。Ⅰ期临床研究结果显示其口服生物利用度为25%～30%，血浆半衰期约为24 h［16］。2007年6月28日，Speedel公司称，SPP-635的一项Ⅱ期临床试验已获得满意结果。在这项有男性和女性共计35名轻至中度高血压患者参加的随机、双盲、安慰剂对照、平行设计的试验中，20名患者单剂量口服使用本品(剂量未公布)，15名患者口服使用安慰剂，每日1次，连续4周。结果显示:SPP-635治疗组中患者收缩压由(156.6± 9.1)mmHg(1 mmHg=133.3 Pa)降至(138.7± 13.3)mmHg(P＜0.001)，舒张压由(91.3±7.8) mmHg降至(81.5±8.2)mmHg(P＜0.001);而安慰剂对照组中患者收缩压和舒张压的降低程度均不明显，分别由(156.1±9.0)和(95.3±5.1)mmHg降至(153.2±8.9)和(93.3±5.4)mmHg，所有受试者在治疗中均未出现严重的不良反应［17］。随后，Speedel公司于2007年年底开始的另一项Ⅱ期临床试验也获得阳性结果。在该项研究中，45名伴有轻至中度高血压和蛋白尿的糖尿病患者被随机分为两组，分别口服不同剂量的SPP-635(200和450 mg·d-1)，每日1次，连续4周。结果显示:本品200 mg·d-1剂量组患者的收缩压和舒张压分别平均下降(6.4±4.73)和(4.1±3.13)mmHg，而450 mg·d-1剂量组患者的收缩压和舒张压分别平均下降(6.6±7.14)和(5.0± 4.31)mmHg;两剂量组不良反应发生率分别为36.4%和30.4%，以神经系统和消化系统不良反应居多，但两组均未出现严重不良反应［18］。

除降血压作用外，SPP-635还能降低因青光眼而导致的眼内压升高，但其作用机制尚不明确［19］。

美国默克公司和瑞士Actelion公司共同研发的MK-8141(ACT-077825，6)为两公司的研发项目中最早进入临床研究的4-芳基哌啶类肾素抑制剂。体外实验测得其对肾素的IC50为0.2 nmoL·L-1，且在血管紧张素原(AGT)-肾素(REN)双转基因高血压大鼠实验中测得其口服生物利用度为24%，两项指标均优于阿利克仑［20］。然而，2009年4月21日，MK-8141因在一项Ⅱ期临床试验中未达到主要考察指标的预期而被中止开发。该项为期4周的研究涉及195名高血压患者，受试者被随机分为4组，分别口服 MK-8141(250或 500 mg·d-1)、依那普利(20 mg·d-1)和安慰剂(500 mg·d-1)。结果显示: MK-8141各治疗组的降压效果不明显，与安慰剂组无显著性差异，而依那普利组的降压效果显著［21］。

Corminboeuf等［22］在研究4-位取代哌啶类肾素抑制剂时，通过引入一些小的亲水基团以改善化合物的性质，发现了对肾素有很强抑制活性(IC50= 1.4 nmoL·L-1)的化合物MK-1597(ACT-178882，7)。瑞士Actelion公司于2009年3月16日启动了该化合物的Ⅰ期临床试验，该项研究涉及的共计40名男性健康受试者被随机分为6组，分别口服不同剂量的MK-1597(30、100、300、600 mg·d-1)、依那普利(20 mg·d-1)和安慰剂，每日1次，连续2周。结果显示:MK-1597(100 mg·d-1)可显著降低PRA，其受试者在第14 d时体内Ang I的质量浓度下降了18.5μg·L-1，且MK-1597对肾素的抑制作用不呈剂量依赖性;而使用依那普利的受试者在第14 d时体内Ang I的质量浓度反而上升了628μg·L-1［23］。

Lacombe等［24］设计并合成了一类新型3，4-二芳基哌啶类肾素抑制剂，发现在哌啶环的4位引入3，4-二氟苯基、哌啶环或N-甲基哌啶-2-酮等结构所得化合物具有较好的体外活性，如化合物8对肾素的IC50为3.4 nmoL·L-1，推测这些基团因可与肾素中氨基酸残基Tyr83和Trp45形成π-π堆积作用和氢键作用而使化合物与肾素的亲和力增强，从而提高了化合物活性。给大鼠和犬经口使用化合物8 (剂量分别为30和3 mg·kg-1)，测得其生物利用度分别为12%和30%;且AGT-REN双转基因大鼠经口使用本品(10 mg·kg-1)后24 h，血压下降了32 mmHg。目前，对该类化合物的结构优化研究尚在进行中。

3 4-芳基哌嗪酮类肾素抑制剂

美国辉瑞公司的Powell等［25］在研究4-芳基哌啶类肾素抑制剂时，发现哌啶环3位上的取代基为R型时化合物活性约为S型的40倍，于是对具有R型4-芳基哌啶骨架的先导化合物进行改造，开发出一类新型4-芳基哌嗪酮类肾素抑制剂。但研究结果显示:与4-芳基哌啶类肾素抑制剂不同，4-芳基哌嗪酮类肾素抑制剂的R和S型异构体活性相似。经X射线晶体衍射分析得知，该类化合物分子中的连接基团具有较大的柔性，从而导致R、S型异构体对肾素S1、S3口袋的占据能力并无显著性差异。其中，化合物9为活性较强的S型4-芳基哌嗪酮类肾素抑制剂(IC50=23 nmoL·L-1)。

Holsworth等［26］以化合物9为先导物，将四氢喹啉环替换为苯并嗪环，并将苯并嗪环上氮原子上的氢以不同侧链取代，所得到的一系列化合物的体外活性均显著增强，如以乙酰氨基丙基取代后所得化合物对肾素的体外IC50为0.29 nmoL·L-1。

然而，进一步研究发现，该系列化合物中大多数都为细胞色素P450酶CYP3A4的强抑制剂。例如，将苯并嗪环改造成苯并嗪酮环，并将与苯并嗪酮环直接相连的氧原子替换为硫原子后所得化合物10对人肾素和CYP3A4的IC50分别为0.18和14 nmoL·L-1。对CYP3A4的抑制会增加药物相互作用的风险，因此，如何在提高该类化合物对肾素的抑制活性的同时，降低其对CYP3A4的抑制活性，是下一步的研究目标。

4 烷基胺类肾素抑制剂

Tice等［27］采用基于结构的药物设计工具ContourTM程序，以肾素晶体结构作为受体，设计了一类口服有效的烷基胺类肾素抑制剂。其中，化合物11虽对血浆肾素的抑制活性较弱(IC50=13 nmol·L-1)，但对肾素的体外IC50达0.47 nmoL·L-1。大鼠实验显示:本品(10 mg·kg-1)经口使用后的生物利用度为12.9%，大鼠血压在24 h内持续下降，在持续给药2～3 d后，大鼠血压显著降低。

Xu等［28］将化合物11中苄位羟基替换为醚链后发现，所得化合物可更好地降低血浆肾素水平，且口服生物利用度较高。其中，化合物12对肾素的体内外抑制活性均较高，IC50分别为0.2和0.48 nmoL·L-1;大鼠和猴经口使用本品(剂量分别为10和1 mg·kg-1)后，测得其生物利用度分别为9.4%和9.9%，为阿利克仑的7～8倍;AGT-REN双转基因高血压大鼠经口使用本品(10 mg·kg-1)后，血压在20 h内持续降低。构效关系研究表明:化合物12的苯基间位氯原子被替换为氟原子或甲基后，其活性基本不变，而替换为氢原子，则活性稍降;苯基3、4、5位引入2个卤原子(氯或氟)，其活性依然保持;烷基链末端N上的甲基替换为乙基或氢原子时，其活性无甚改变。

Jia等［29］将化合物12的脲基右侧氮α位碳上的环己基移至β位，并在环己基中引入氧原子，得到一个活性化合物VTP-27999(13)，其对肾素的体外IC50达0.3 nmoL·L-1，对血浆肾素的IC50为1.1 nmoL·L-1;大鼠和猴经口使用本品(剂量分别为10和2 mg·kg-1)后，测得其生物利用度分别为37%和18%。

VTP-27999已由美国Vitae公司和葛兰素史克公司联合开发，并成为首个进入临床试验的烷基胺类小分子口服肾素抑制剂。在2010年启动的一项Ⅰ期临床试验中，给24名健康受试者分别口服4种剂量的VTP-27999(75、150、300和600 mg·d-1)，并以阿利克仑(300 mg·d-1)和安慰剂作对照，每日1次，连续10 d。结果显示:VTP-27999的口服生物利用度达30%，安全性和耐受性良好;且与最大临床剂量的阿利克仑(300 mg·d-1)相比，3种较高剂量(150、300和600 mg·d-1)的VTP-27999能更明显地降低PRA，抑制率达90%以上［30］。基于Ⅰ期临床试验的阳性结果，Vitae公司拟启动VTP-27999的Ⅱ期临床试验。

Yuan等［31］在借助药物设计工具 ContourTM程序，对阿利克仑和化合物11与肾素的结合模式进行比较时发现，阿利克仑结构中仅相隔一个碳的苯基和异丙基分别占据肾素S1、S3口袋，而化合物11的结构中以哌啶环连接的苯基和环己基亦分别占据S1、S3口袋。鉴于阿利克仑对肾素的抑制活性强于化合物11，该研究团队参照阿利克仑的结构，改变化合物11基团的拼接方式，将可占据S3口袋的环己基替换为苯基，并将该苯基与可占据S1口袋的苯基的邻位相连形成联苯结构。由此结构优化所得化合物14能高选择性作用于肾素(IC50= 1.1 nmoL·L-1)，而对其他类型的天冬氨酸蛋白酶(如组织蛋白酶D、β-分泌酶)的抑制活性很弱。

给高血压模型大鼠经口使用化合物14 (10 mg·kg-1)后，测得其生物利用度为19%，致大鼠血压在12 h内降低20 mmHg以上。构效关系研究表明:将化合物14的联苯替换为二苯醚后其活性无甚变化;环戊基上同时有羟基和氨基取代，其活性远高于只有氨基取代;苯环上氯原子取代替换为氟原子或无卤素取代时，其活性稍有降低;末端苯环上乙基取代替换为甲基取代时，其活性也降低。然而，该类化合物也具有CYP 3A4抑制活性，故同样存在药物相互作用的风险。

5 吲哚及氮杂吲哚类肾素抑制剂

吲哚及氮杂吲哚类肾素抑制剂由法国赛诺菲-安万特公司开发，目前尚无相关药物进入临床研究。例如，Scheiper等［32］通过高通量筛选得到一个含有吲哚环的活性分子，结合X射线晶体衍射和分子对接的方法，在该吲哚环骨架的基础上进行结构优化，获得一类肾素抑制剂化合物。其中，吲哚环2位为苄基的化合物因苄基可占据肾素S1口袋而与肾素的Tyr75形成π-π堆积作用，使其与肾素的亲和力增加，从而导致活性显著增加，如活性最强的化合物15对肾素的体外IC50为2 nmoL·L-1。构效关系研究表明:吲哚环2位苄基上无取代基取代时，该类化合物活性明显下降;苄基替换为单甲基取代的苯氧基或苯硫基后，其活性也不同程度地下降;吲哚环3位N-酰基哌嗪环上有甲基或羟甲基取代时，其活性大幅下降;吲哚环5或6位有羟基取代时，其活性增强。

Scheiper等［33］利用基于结构的药物设计、X射线晶体衍射和平行合成等多种手段，在吲哚类肾素抑制剂结构基础上，合成了一类具有4或6位氮杂吲哚环骨架的肾素抑制剂;而在具有6位氮杂吲哚环骨架的化合物中，化合物16的活性最好，其对肾素的体外IC50达2 nmoL·L-1。且研究发现，当该类化合物的氮杂吲哚环2位的苯氧基上有二甲基取代时，其活性显著增加，此源于二甲基可使苯氧基牢牢占据肾素S1口袋，从而增加化合物与肾素的亲和力。该类抑制剂的构效关系与吲哚类肾素抑制剂基本一致。

Matter等［34］在上述研究的基础上，设计了一类具有5或7位氮杂吲哚环骨架的肾素抑制剂，主要修饰部位包括:苯氧基或苄基、吲哚氮原子上取代基、哌嗪环取代基和吲哚环6位取代基。结果显示:该类抑制剂中活性最强的化合物对肾素的体外IC50达3～8 nmoL·L-1，如化合物17的IC50达6 nmol·L-1，且经Caco-2细胞模型试验表明其有较高的胃肠道吸收率(表观渗透系数为2.2×10-6cm·s-1)，提示其生物利用度较高。

6 2,4-二氨基嘧啶类肾素抑制剂

美国辉瑞公司的Powell等［35］采用基于结构的药物设计方法，将该公司2个先导化合物活性药效团2，4-二氨基嘧啶与苯并嗪(酮)环拼接，设计了一系列2，4-二氨基嘧啶类肾素抑制剂。研究发现，该类化合物的苯并嗪(酮)环可占据肾素的S3疏水口袋，若嗪(酮)环2位上有疏水取代基则可与S3口袋中的氨基酸残基产生疏水作用，从而增强化合物与肾素的亲和力，而该位置上无取代基的化合物因缺少这种作用则活性极低。研究还发现，具有相同取代基的苯并嗪类化合物与苯并嗪酮类化合物的活性也存在很大差异。例如，苯并嗪环的2位上以甲基取代而得到的消旋体化合物18对肾素的体外IC50为235 nmoL·L-1，其R与S型异构体的活性相当，IC50分别为325和310 nmoL·L-1;在苯并嗪酮环的2位上同样以甲基取代所得消旋体化合物的肾素抑制活性稍弱(IC50=520 nmoL·L-1)，但其R型异构体的活性是S型异构体的8倍，IC50分别为125和1 049 nmoL·L-1。究其原因，可能是嗪酮的羰基增加了分子的刚性，使R型异构体更利于与肾素结合，而嗪环上因无羰基而使结构更具柔性，使得R与S型异构体在空间构象上的差异并不显著，导致2种异构体与肾素的亲和力相似。目前该类化合物尚有待进一步的结构优化，以提高其活性。

7 吗啡啉类肾素抑制剂

日本三菱田边(Mitsubishi-Tanabe)制药公司与上海医药集团的项目合作小组通过对阿利克仑与4-芳基哌啶类肾素抑制剂的药效团的深入研究，共同开发了一系列含有单环或双环的吗啡啉类肾素抑制剂。构效关系研究表明:该类抑制剂结构中的吗啡啉环、环丙胺基、芳香环和甲氧基丙氧基均为重要的药效团，X射线晶体衍射显示:上述基团可分别占据肾素的S1'、S1、S3和S3sp口袋，这与阿利克仑十分相似;当芳香环为刚性双环结构(如萘环、吲哚环和喹啉环)时，化合物活性显著提高，尤其是在萘环上引入卤素取代后，其活性进一步提高，其中，(R)-N-(1-溴-4-(3-甲氧基丙氧基)-2-萘甲基)-N-环丙基吗啡啉-2-甲酰胺(19)的活性最强，其体外IC50为3.91 nmoL·L-1，而具有喹啉环结构的化合物，其苄位引入甲基后，活性也会增加［36］。目前，吗啡啉类肾素抑制剂中活性较好的一些化合物已进入临床试验阶段。

8 大环类肾素抑制剂

瑞典Medivir公司的Sund等［37］在分析拟肽类肾素抑制剂与肾素的结合模式时发现，拟肽类肾素抑制剂分子中可旋转键太多，柔性太大，导致拟肽类肾素抑制剂的药动学性质不佳，表现为生物利用度低、稳定性差及生物膜渗透率低。为解决这一问题，该研究小组将拟肽类肾素抑制剂分子的P1和P3部分连接起来(见图1)，形成一个大环内酰胺结构，所得化合物均为消旋体，以化合物20为代表。X射线晶体衍射实验显示:当化合物20结构中大环上取代的苯基为S型时，可占据肾素的S3sp口袋，与苯基为R型时相比，提高了化合物与肾素的亲和力，因此，获得该化合物的S型异构体的意义重大，但目前手性拆分该化合物的尝试尚未获成功。此外，研究发现，与甲基、甲氧乙基等基团相比，该类化合物大环上取代的苯基作为P3sp基团(即占据肾素S3sp口袋的基团)，可增强化合物对肾素的亲和力，从而提高其对肾素的抑制活性。体外实验测得，化合物 20对肾素的 Ki为34 nmoL·L-1，其代谢稳定性也好于拟肽类肾素抑制剂，但渗透率并未得到改善，且易被P-糖蛋白降解。故需对该化合物作进一步的结构优化，以改善其药动学性质。

图1 拟肽类肾素抑制剂结构式示意图Figure 1 Schematic diagram of chemical structure of peptidomimetic rennin inhibitor

9 结语

RAAS是治疗高血压的常用靶点，特别对于患有糖尿病的高血压病人，肾素抑制剂所起的作用不容忽视［38-39］。尽管大量临床及临床前实验表明肾素抑制剂疗效较好，但在实际应用过程中仍存在诸多问题。例如，肾素抑制剂虽能降低PRA，但会引起肾素分泌增加，从而导致血浆肾素浓度(PRC)升高，而血浆中高浓度的肾素还会激活体内纤维化的信号传导通路，导致组织纤维化;当其与ACEI和ARBs联用时，由于ACEI和ARBs的负反馈调节作用，会导致PRA增加，从而使疗效下降［40］。阿利克仑已上市5年，但仍因生物利用度低、不良反应多等问题，而在使用上受到限制，除阿利克仑外，其他在研的肾素抑制剂尚处于临床早期及临床前研究阶段，潜在的副作用与不良反应还有待长期观察，其过长的开发周期和不确定的安全性导致了肾素抑制剂的上市药物寥寥无几。不过，目前关于肾素抑制剂在抗高血压中的作用机制的研究取得了较大进展，使运用合理药物设计的方法寻找活性强、代谢稳定、生物利用度高的肾素抑制剂成为了可能。综上所述，以肾素为靶标，从分子水平寻找疗效确切的抗高血压药物，将成为高血压治疗的新的突破点。

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