5－FU诱导人肝细胞癌MDR的比较蛋白质组学研究

韦 艳，张海英，梁 钢*

(1.武警广西总队医院，广西南宁530003;2.广西医科大学药学院，广西南宁530021)

5－FU诱导人肝细胞癌MDR的比较蛋白质组学研究

韦 艳1，张海英2，梁 钢2*

(1.武警广西总队医院，广西南宁530003;2.广西医科大学药学院，广西南宁530021)

目的 寻找与人肝细胞癌多药耐药相关的蛋白质分子，为进一步研究人肝细胞癌多药耐药机制提供依据。方法 体外培养人肝癌细胞Bel-7402及其耐5-氟尿嘧啶(5-FU)细胞Bel-FU，MTT法检测Bel-FU的多药耐药性，双向凝胶电泳技术分析细胞Bel-7402与Bel-FU之间的差异表达蛋白，经MALDI-TOF/TOF质谱鉴定。Western blot验证2-DE及质谱的检测结果。结果 与Bel-7402比较，Bel-FU中有24个蛋白表达上调，其中包括FAK、TM3、ORP150、CRT、hnRNP K、80K-H protein、EF-1-D、phosphoprotein 等，12 个蛋白表达下调。Western blot法检测到蛋白FAK、CRT在Bel-FU中高表达，与2-DE结果一致。结论 通过建立人肝癌细胞Bel-7402及其耐5-氟尿嘧啶细胞Bel-FU的2-DE图谱筛选了多药耐药相关的差异蛋白，为人肝细胞癌MDR的分子机制研究奠定了基础。

肝细胞癌;多药耐药;比较蛋白质组学;双向凝胶电泳

目前化学药物治疗作为肝癌临床治疗主要手段之一，面临的最大难题就是多药耐药［1］(multidrug resistance，MDR)，这是指肿瘤细胞对某一种药物产生耐药性后，该肿瘤细胞逐渐对那些结构无关、作用靶点不同，甚至是未接触过的、机制不同的抗肿瘤药物也具有交叉耐药性。肿瘤MDR的发生机制非常复杂，通常认为是由一系列基因的失活与激活而导致的，然而从功能的角度上来看，无论是基因的突变还是转录及翻译后的变化，其结果都导致基因表达产物的改变，从而改变了蛋白质信号通路，因此有必要从蛋白质整体水平来研究肿瘤细胞MDR。本研究基于比较肿瘤细胞、耐药细胞之间蛋白质的表达水平，以发现相关的特异性蛋白，为揭示肿瘤MDR发生的分子机制、防治以及靶点的发现提供科学依据，对新药开发也更具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞:人肝癌细胞系Bel-7402(南京凯基生物科技发展有限公司)。

1.1.2 试剂:5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)、长春新碱(vincristin，VCR)和阿霉素(adriamycin，ADM)(浙江海正药业公司)，柔红霉素(Daunorubicin，DAN)和阿糖胞苷(cytarabine)(上海华联制药有限公司)，尿素、硫脲、CHAPS和DTT(Amresco公司)，IPG 缓冲液、IPG 胶条(pH4-7，24 cm，GE 公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养:用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，置37℃、5%CO2的培养箱中培养。倒置相差显微镜观察细胞生长情况，0.25% 胰蛋白酶消化传代，Bel-FU细胞培养时加入20 mg/L 5-氟尿嘧啶维持其多药耐药性，实验前停1周，取对数生长期细胞用于实验。

1.2.2 甲基四唑蓝(MTT)法测定肝癌耐药细胞Bel-FU多药耐药性:实验分亲本细胞和耐药细胞两组，每组设空白对照组(只加培养液)，阴性对照组(只加细胞)，抗癌药物组。取单细胞悬液1×105个/mL种于同一 96孔板中，每孔100 μL置37℃、5%CO2的培养箱中培养过夜。分别加入不同浓度的抗癌药物5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、阿霉素、长春碱，以上药品均以注射用0.9%氯化钠注射液配成母液，使用时用培养液配成一系列的稀释液，终体积至200 μL。培养48 h后，每孔加入20 μL MTT(5 g/L)，继续培养4 h，终止培养弃培养液，每孔加入150 μL DMSO，振荡10 min，充分溶解蓝紫色结晶，酶标仪选择波长492 nm测吸光度值，实验不同日重复3次取均数。计算细胞抑制率(inhibitive rate，IR)=(阴性对照组吸光度值－抗癌药物吸光度值)/阴性对照组吸光度值×100%，LOGIT软件计算求得IC50(50%inhibiting concentration，半抑制浓度)。耐药指数(resistance index，RI)=耐药细胞株IC50/亲本细胞株IC50。

1.2.3 细胞总蛋白的提取:取对数生长期细胞，用PBS清洗3次，尽量让培养瓶中不要残留PBS。根据培养瓶底表面积的大小加入蛋白裂解液(瓶底面积每1 cm2加入10 μL蛋白裂解液)。让裂解液充分与细胞接触，静置冰上裂解40 min，收集瓶中的裂解液，涡旋振荡5 s×2次，4℃ 30 000 r/min离心50 min，取上清，蛋白质定量试剂盒 2D Quantifi2cation kit定量。

1.2.4 双向凝胶电泳(2-DE)及差异蛋白质点的质谱鉴定:取样品蛋白加入IPG缓冲液2.5μL，再加入水化储存液使总体积至450 μL。设置IPGphor仪器的运行参数。程序结束后取出胶条进行平衡，IPG胶条平衡2次。装好灌模具，灌胶。将平衡好的胶条小心的放置于胶面上并轻压使胶条与胶面充分接触，并覆盖2 mL琼脂糖溶液后开始电泳。硝酸银染色程序如下:固定30 min，敏化30 min，漂洗5 min×3次，银染20 min，漂洗1 min×2次;显色后加入适量冰醋酸终止。染色后的凝胶经ImageScanner扫描仪扫描获得蛋白质点图谱，所得图谱用ImageMaster 2-DE Platinum 5.0软件分析。图像分析过程包括背景消减、获取蛋白质斑点位置坐标等的校正，然后分别将同种细胞3次电泳所得的蛋白质点图谱在软件中创建平均胶，以其中一组的平均胶为参照胶与另一组的平均胶进行匹配，寻找两种细胞间差异表达的蛋白质点。蛋白点灰度值差异达到2.5倍以上认定为差异蛋白。将差异蛋白质点切下，进行酶解，提取酶解的肽段后脱盐，进行MALDI-TOF-MS检测，通过rNCBI数据库获取蛋白质点的信息。

1.2.5 Western blot法检测FAK、CRT蛋白表达:消化收集细胞，加入适量细胞裂解液，冰上放置30 min，10 000×g离心40 min取上清，bradford 法测定提取蛋白的浓度。进行十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离胶浓度为7%，浓缩胶浓度为4%。采用湿法转膜，200 mm/mol恒流，转移时间2 h。5%BSA封闭4℃过夜，与一抗、二抗杂交反应后，过氧化物酶HRP-ECL显影，扫描后应用quantity-one软件分析。

1.3 统计学分析

MTT法中数据以均数±标准差(±s)表示，药物对细胞的半数抑制浓度IC50值根据LOGIT计算软件确定。组间均数的比较采用t检验，采用SPSS16.0软件分析。

2 结果

2.1 肝癌耐药细胞多药耐药性

耐药细胞Bel-FU对5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、长春新碱、阿霉素和柔红霉素的耐药指数分别为89.6、3.9、37.1、15.0 和3.7 倍(P＜0.05)(表1)。

表1 Bel-FU对各种抗癌药物的耐药指数Table 1 Resistance index of Bel-FU to different anticancer drugs(±s，n=3)

表1 Bel-FU对各种抗癌药物的耐药指数Table 1 Resistance index of Bel-FU to different anticancer drugs(±s，n=3)

*P ＜0.05 compared with Bel-7402．

drug IC50(μmol/L)RI Bel-7402 Bel-FU 5-FU 36.21±4.80 3243.52±67.52*89.6 cytarabine 3.72±0.54 14.51±2.19* 3.9 VCR 0.74±0.13 27.45±2.19* 37.1 ADM 2.20±1.03 33.08±6.16* 15.0 DAN 1.23±0.13 4.55±0.89*3.7

2.2 2-DE凝胶图谱

图1为细胞Bel-7402与Bel-FU总蛋白双向电泳凝胶图以及之间的36个差异蛋白点。与Bel-7402比较，24个蛋白点在Bel-FU上调，分别编号为1 至 17、23、31、32、33、34、35、36 和 12 个蛋白点在Bel-FU 下调，分别编号为 18、19、20、21、22、24、25、26、27、28、29和 30。图2 为 Bel-7402 与 Bel-FU 之间部分差异蛋白点的放大图。

2.3 差异表达蛋白质的质谱检测选结果

选取在细胞Bel-FU中高表达的部分差异蛋白点进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定(编号为2、3、5、8、9、10、12 和15 的8 个蛋白质点)。通过搜索NCBInr数据库，获取各蛋白质点信息(表2)。

表2 各差异蛋白质点信息Table 2 Information of the differential expression protein

2.4 Western blot检测蛋白FAK、CRT的表达

敏感细胞Bel-7402与耐药细胞Bel-FU中蛋白FAK、CRT表达变化情况(图3)。各组细胞样品蛋白中 FAK/β-actin、CRT/β-actin 比值(表3)。

图3 FAK、CRT蛋白表达区带Fig 3 The Western blot of FAK and CRT

表3 FAK、CRT蛋白表达变化Table 3 The differential expression of FAK and CRT(±s，n=3)

表3 FAK、CRT蛋白表达变化Table 3 The differential expression of FAK and CRT(±s，n=3)

*P＜0.05 compared with Bel-FU．

ratio Bel-7402 Bel-FU FAK/β-actin 0.550 ±0.031*0.969±0.064 1.030±0.071 CRT/β-actin 0.659 ±0.024*

3 讨论

MTT实验显示5-氟尿嘧啶诱导的耐药细胞对5-氟尿嘧啶具明显抗药性，对长春新碱、阿霉素有交叉抗药性，对阿糖胞苷、柔红霉素的抗药性较小。通过对两组双细胞样品双向凝胶电泳蛋白质图谱进行分析比较，在pH 4～7范围的凝胶图谱里，Bel-7402组与Bel-FU组之间的差异蛋白中，经MALDITOF MS鉴定了8个在Bel-FU细胞中高表达的蛋白，分别为:黏着斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)、低氧上调蛋白 1(hypoxia up-regulated 1，HYOU1 protein)、葡萄糖苷酶Ⅱ(glucosidaseⅡ)、钙网蛋白(calreticulin，CRT)、蛋白激酶C底物80K-H蛋白(80K-H protein)、原肌球调节蛋白(tropomodulin 3)、延伸因子1(elongation factor-1-delta)、异源核糖核蛋白K(heterogeneous nuclear ribonucleo protein K，hnRNP K)，经 Western blot验证 FAK、CRT在耐药细胞中呈现出高表达。这些表达量上调的蛋白分子功能主要与细胞结构、细胞周期、增殖、凋亡、能量代谢及核酸合成与代谢相关。

耐药细胞中FAK的高表达提示抑制化疗药物诱导的细胞凋亡［2－3］。细胞间黏附和群集是产生耐药的原因之一，已有研究证实反义FAK寡核苷酸可有效地干预细胞黏附，促进肿瘤细胞凋亡，而这些都可能影响到化疗药物的敏感性［4］，以FAK为靶点的对抗细胞附性治疗对肿瘤耐药会有逆转作用。在Bel-FU细胞中FAK上调倍数达到3倍以上，由此推测，FAK可能是5-FU诱导细胞耐药的关键因子之一;HYOU1也称为氧调节蛋白150(oxygen-regulated protein，ORP150)，其高表达提示耐药可能是通过促进内质网应激反应从而对肿瘤细胞起到保护的作用来实现的。有研究发现［5］，人肝癌细胞中ORP150基因及蛋白表达均高于正常肝细胞中的表达量，经反义RNA技术后肝细胞癌的凋亡明显增加而侵袭性无改变，ORP150有望成为肝细胞癌MDR的治疗靶点;葡萄糖苷酶Ⅱ作为胰岛素作用通路上的调节酶，其活性升高不仅与糖尿病和胰岛素抵抗有关，并且能与多种激素介导细胞代谢、增殖的信号通路调控，而这些信号通路的异常活跃与肿瘤的发生、发展亦有密切关系，目前葡萄糖苷酶Ⅱ具体通过哪些细胞信号转导通路参与了MDR还有待研究和探讨。CRT是一种普遍存在且高度保守的内质网钙结合蛋白，CRT通过调节肿瘤抗原的递呈、抑制血管的生成而与肿瘤的发生密切相关，有研究比较分析了肝癌患者、肝癌高危人群及正常人中蛋白质的表达差异，结果前者血液中CRT及其裂解片段远高于后两者［6］。在本实验中，耐药细胞中CRT的高表达量对MDR机制研究中具有重要的意义;蛋白激酶C底物80K-H蛋白的上调，多见于多囊性肝病，而实验中发现其在耐药细胞中高表达很可能预示细胞中蛋白激酶C含量的增加耐导致耐药;原肌球蛋白(tropomyosin，TM)是通过稳定肌动蛋白的状态参与肌肉收缩的重要蛋白，在诱导细胞间质的转移以及细胞调亡中起重要作用。已有研究报道原肌球蛋白在肿瘤转移和耐药细胞中呈现高表达，如:在人急性早幼粒细胞白血病维甲酸敏感细胞株和维甲酸耐药细胞株的差异耐药相关蛋白中，也发现原肌球蛋白在耐药细胞中呈现高表达的情况，提示了原肌球蛋白参与了肿瘤耐药过程［7］。在肝癌转移亚细胞中原肌球蛋白表达上调［8］，提示该蛋白在参与肿瘤转移过程所起的重要作用，因此是否可以把原肌球蛋白作为筛选抗肿瘤药和逆转肿瘤MDR剂的靶点将有待后期的继续研究。hnRNP K属于RNA结合蛋白亚家族的一种多功能蛋白分子，目前已有研究证实hnRNP K与乳腺癌、淋巴瘤等肿瘤的发生和发展密切相关［9－10］。并且发现DNA损伤后可引起hnRNPK作为转录激活因子，通过增强P53、C-MYC、EGR和BRCA1基因的表达［11］因此 hnRNPK可能通过激活肿瘤MDR相关的基因转录而产生耐药。由此可见，由5-FU诱导的肝癌细胞MDR是通过多途径多通道的机制实现的，筛选出的这些差异蛋白质为今后的MDR深入研究提供了重要的依据。

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Comparative proteomics analysis of human hepatocellular carcinoma MDR induced by 5-FU

WEI Yan1，ZHANG Hai-ying2，LIANG Gang2*

(1.Guangxi Provincial Crops Hospital of Chinese People's Armed Police Force，Nanning 530003;2.Pharmacy College，Guangxi Medical University，Nanning 530021，China)

ObjectiveTo search the protein from human hepatocellular carcinoma MDR and provide evidence for the mechanism of hepatocellular carcinoma MDR．MethodsHuman hepatocellular carcinoma cell line Bel-7402 and 5-FU resistant cell line Bel-FU were cultured．The MDR of Bel-FU was detected by MTT assay，to screen the differential expression protein between Bel-7402 and Bel-FU by 2-DE and MALDI-TOF/TOF．ResultsCompared with those in Bel-7402，24 proteins were up-regulated in Bel-FU including FAK，TM3，ORP150，CRT，hnRNP K，80K-H protein，EF-1-D，phosphoprotein and so on，and 12 proteins were down-regulated．Western blot confirmed that FAK and CRT were up-regulated in Bel-FU，the results were in accordance with the results of 2-DE．ConclusionsThe differential expression protein between Bel-7402 and Bel-FU may support the study of molecule mechanism of MDR．

hepatocellular carcinoma;multidrug resistance;comparative proteomics;2-DE

R 966

A

1001-6325(2012)09-1015-06

2011－10－20

2011－12－28

国家自然科学基金(30760310);广西地方性高发疾病防治研究重点实验室基金(桂科能0842009-k6);广西科学基金(桂科自0728113);广西中医药研究院中药质量标准研究重点实验室开放课题基金(桂中重开0801)

*通信作者(corresponding author):Lianggang22@yahoo．com．cn