子宫内膜异位症中HO-1的表达与内膜细胞凋亡的相关性研究

谭风和 李 萍

(1. 滨州医学院烟台附属医院妇产科，山东 牟平 264100；2. 泰山医学院附属医院妇产科，山东 泰安 271000；)

逆流种植、体腔上皮化生和诱导学说是EMT[1]的主要病因。郎景和提出了“在位内膜决定论”，认为子宫内膜在宫腔外需要经过粘附、侵袭、血管形成才得以种植、生长、发生病变，起决定作用的可能是在位内膜的特性[2]。研究表明，异位内膜完成上述过程中，起重要作用的可能是子宫内膜细胞的凋亡、机体全身及局部免疫状态和功能、激素、细胞因子等。本研究采用免疫组化技术检测HO-1、Bcl-2和FasL在正常子宫内膜、EMT在位、异位内膜组织中的表达，初步探讨EMT发病与HO-1、Bcl-2和FasL的关系。

1 材料与方法

1.1资料 2006年5月至2009年12月泰山医学院附属医院临床病理资料完整的子宫内膜异位症患者的石蜡包埋标本41例，其中增生期21例，分泌期20例。选取以上行卵巢子宫内膜异位囊肿手术患者34例，其中增生期18例，分泌期16例，获取在位内膜；选取诊断性刮宫或手术切除子宫并经病理证实为正常子宫内膜标本32例，其中增生期16例，分泌期16例。选取对象年龄31～51岁。

所有参与者3个月内未应用激素治疗,无其它内外科及内分泌疾病,月经周期规律,根据病理结果划分增生期和分泌期。所有组织取材后经10%甲醛固定,石蜡包埋, 5μm连续切片5张, 其中1张行常规HE染色后进行形态学观察,剩余者行免疫组化染色。

1.2方法 采用免疫组化SABC法检测3项指标的蛋白表达，HO-1、Bcl-2、FasL抗体，SABC免疫组化试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司。操作按试剂盒说明。

1.3结果 判定HO-1的阳性部位主要定位于子宫内膜腺上皮细胞胞浆中，少量定位于子宫内膜胞膜和胞核。FasL的阳性部位主要定位于子宫内膜腺上皮细胞胞浆中。Bcl-2的阳性部位主要定位于子宫内膜细胞膜和胞浆中。应用计算机彩色图文病理分析系统观察每张切片的蛋白表达情况。免疫组化染色后选取染色清晰、定位明确、结构完整的棕黄色细胞作为阳性表达。高倍镜下随机选取10个视野，计数1000个细胞，根据阳性细胞所占比例和阳性细胞染色强度进行定量测定[18]。阳性细胞所占比例评分为：阳性细胞数<10%为0分；11%～40%为1分；41%～70%为2分；>70%为3分；染色强度评分标准:不着色0分；黄色1分；棕黄色2分；黄褐色3分。二者评分相加，0-1分为阴性；2分以上为阳性。

1.4采用SPSS17.0统计软件进行数据处理，采用四格表χ2检验及Fisher精确概率法。取检验水准为α=0.05。

2 结 果

2.1HO-1在各实验组内膜组织中的表达

HO-1增生期和分泌期异位内膜组表达强于在位内膜组及对照组(P<0.05)；对照组及在位内膜组HO-1表达随月经周期而发生变化, 分泌期显著强于增生期，异位内膜组HO-1表达失去周期性变化。

表1 HO-1在各实验组中的表达

*：与同分期在位内膜组比较P=0.001；△：与同分期正常对照组比较P=0.001

2.2Bcl-2在各实验组内膜组织中的表达

Bcl-2增生期和分泌期异位内膜组表达均强于在位内膜组及对照组(P<0.05)；对照组及在位内膜组Bcl-2表达随月经周期而发生变化，增生期显著强于分泌期，异位内膜组Bcl-2表达失去周期性变化。

表2 Bcl-2在各实验组中的表达

*：与同分期在位内膜组比较P=0.02；△：与同分期正常对照组比较P=0.02；#：应用Fisher精确法计算概率。

2.3FasL在各实验组内膜组织中的表达

FasL在位内膜和异位内膜中的表达均高于同期正常子宫内膜的表达，FasL在正常子宫内膜的表达具有周期性，增生期明显低于分泌期(P<0.05)；在在位内膜和异位内膜中的表达则失去周期性变化。

表3 FasL在各实验组中的表达

*：与同分期在位内膜组比较P=0.005；△：与同分期正常对照组比较P=0.001；#：应用Fisher精确法计算概率

3 讨 论

3.1HO-1在EMT中的表达及意义

HO-1是一种在机体内广泛存在的抗氧化防御酶，其主要作用方式为通过其酶解产物在体内发挥抗炎、抗氧化、抑制细胞凋亡等作用。HO-1能降解血红素产生CO、胆绿素和铁离子等产物。目前，HO-1与EMT发生、发展的相关性研究较少。有研究发现, HO-1可以引起铁、胆绿素和CO的局部产物的过度表达，在异位子宫内膜损伤性出血的部位，高铁和胆红素沉着物的存在是受抑制的，另外，CO作为血管舒张因子，对损伤性新生血管的行成起一定的作用。多数研究认为HO酶解反应对细胞起保护作用，是机体对抗氧化应激的一种代偿性机制。有研究表明[3]，HO-1的表达在有诱导剂诱导的情况下，HO-1缺陷动物对氧化应激的易损伤性比对照组高。实验发现，HO-1缺陷的成年鼠会有缺铁性贫血及肝、肾铁的聚积，这会导致组织的氧化损伤，而且这些动物在进行器官移植后，出现排异反应的概率也会增加，也更容易出现异常的炎症性反应。

本研究表明：HO-1在正常子宫内膜增生期不表达或呈弱表达, 在分泌期表达阳性率增加(P<0.01), 提示HO-1的表达与月经周期明显相关；在位内膜的表达高于同期正常子宫内膜(P<0.05)；异位内膜组织中, HO-1呈高表达且无周期性变化, 与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)。这提示HO-1 在EMT中的过度表达可能促进了异位内膜组织在宫腔外的种植与生长，表明EMT患者体内的HO系统不能完全降解血红素， HO-1的过度表达可能参与了EMT的发病机制及疾病进程。

3.2Bcl-2在EMT中的表达及意义

在正常子宫内膜增生期中，Bcl-2蛋白强表达，促进细胞的增殖，抑制子宫内膜的凋亡，从而使子宫内膜在月经期脱落后可以从基底层修复；在分泌期Bcl-2弱表达，能促进细胞凋亡，使内膜的过度增殖受到抑制，防止发生内膜增生性疾病。Ioffe等[4]发现正常子宫内膜的凋亡现象与月经周期存在着密切的关系。另有研究表明[5]，盆腔EMT患者分泌期子宫内膜Bcl-2过度表达，使细胞抗凋亡能力增强，使逆流到盆腔的内膜细胞依旧有较高活性，而使其在盆腔存活，使EMT的发病成为可能。EMT患者在位内膜的细胞凋亡率低于正常妇女,其异位内膜细胞凋亡率比其在位内膜更低，这可能是由于该病患者月经子宫内膜中凋亡细胞所占比例减少，而逆流入腹腔的内膜细胞仍具有活性，增加了种植、存活的机会。子宫内膜异位至腹腔后，由于其凋亡率下降更不易发生凋亡，从而促进了EMT的发生与发展。

本研究结果表明：Bcl-2在正常子宫内膜增生期的表达高于分泌期(P<0.05)；在在位内膜增生期的表达亦高于分泌期(P<0.05)；异位内膜Bcl-2的表达增生期与分泌期无显著差异，呈高表达而且没有周期性，均高于正常内膜和在位内膜(P<0.05)。这说明EMT患者,由于Bcl-2的强表达，造成其异位内膜细胞的凋亡能力下降，使细胞凋亡减少，破坏了子宫内膜细胞增生和凋亡间的平衡关系，导致异位内膜细胞在“异地”种植、生长，形成EMT。

3.3FasL在EMT中的表达及意义

Fas/FasL系统是将凋亡信号转导入细胞内的主要系统之一。Garcia Valasco等[6]研究表明EMT患者的腹腔液在炎症就是通过异位的内膜细胞诱导FasL的表达，来杀伤由Fas介导的免疫活性细胞。这可能就是异位内膜细胞未被免疫排斥，进而在异位能够种植和生长的原因。异位内膜组织可能通过激活FasL基因的转录使FasL蛋白过表达，而通过低表达Fas蛋白抵抗由Fas介导的细胞凋亡作用，，从而使Fas阳性的免疫细胞出现凋亡，使得异位组织被免疫监督与清除的情况减弱，最终使得宫腔外的异位内膜种植、存活，使EMT的发生成为可能。

本研究表明：FasL蛋白的表达主要分布于子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞的胞浆或胞膜；在正常对照组的子宫内膜有少量表达，分泌期高于增生期 (P<0.05)；在位内膜的分泌期表达低于正常对照组(P<0.05)；异位内膜FasL蛋白的表达均高于正常对照组，且无周期性变化。这说明，增生期FasL 低表达，细胞凋亡减少，使子宫内膜腺上皮细胞增生增加；进入分泌期后，FasL表达增强，腺上皮细胞受凋亡基因的影响而发生凋亡； FasL在异位内膜中的表达在增生期与分泌期无明显差异，且同期表达显著高于正常内膜及在位内膜。由此我们可以推测， FasL在异位内膜组织中的高水平表达是可能与其逃避机体内的免疫杀伤有关，使异位内膜细胞避免免疫清除而继续存活、生长，进而使EMT的发生成为可能。另外，FasL在异位内膜的无周期性表达也能够使避免在月经期的自杀性死亡。在育龄妇女中经血逆流较常见而EMT的发生率却不高，这可能与子宫内膜的周期性改变受促凋亡基因的控制，在分泌期子宫内膜凋亡程度增高，细胞活性降低有关。

[1] 曹泽毅.妇产科学[M].北京:人民卫生出版社,2008:471.

[2] 郎景和.子宫内膜内异症研究的新里程[J].中华妇产科杂志,2005,40(l):3-4.

[3] Dennery PA, Spitz DR, Yang G, et al. Oxygen toxicity and iron accumulationin the lungs of mice lacking heme oxygenase-2[J]. J Clin Inwest, 1998, 101(5): 1001-1011.

[4] Ioffe OB, Papadimitriou JC, Drachenberg CB. Correlation of proliferation indices, apopmsis, and related oncogene expression (Bcl-2 and C-erbB-2) and p53 in proliferative, hyperplastic and malignant endometrium [J]. Hum Pathol, 1998, 29(10): 1150-1159.

[5] 赵建武,令狐华.子宫内膜异位症在位内膜Bcl-2的表达及其意义[J].贵州医学,2001,24(11):611-612.

[6] Garcia valasco JA,et al. Macrophage derived growth factors modulate Fas ligand express in cultured endomctril stromal cues: a role in endometriesis [J]. Mol Hum Reprod, 1999, 5(7): 640．