慢性肢体淋巴水肿动物模型的构建

侯传强 金 星 吴学君 李宝江

(1. 泰山医学院附属泰山医院乳腺外科，山东 泰安 271000；2. 山东省立医院血管外科，山东 济南 250021)

肢体淋巴水肿模型的构建对于研究淋巴水肿发病机制、探讨有效治疗方法至关重要。长期以来多种造模方法，多种实验动物如狗、兔、大白鼠等都曾被用来造模。本实验采用先施行环切手术后短期内放疗的方法制作兔后肢淋巴水肿模型。

1 实验动物与方法

1.1实验动物 新西兰大白兔20只，山东省农业科学院实验兔场提供，体重在2.5 kg左右(2.0～3.0 kg)，雌雄不限。右后肢作为实验肢体，左后肢作为对照。

1.2手术方法

用2.5%的戊巴比妥钠麻醉，大约剂量为1 ml/kg体重，根据角膜反射和兔肢体对外力过伸运动反应及呼吸深浅及幅度调整麻醉剂量。麻醉成功后，剪去下肢手术区(腹股沟远端约6 cm区域)长毛，用脱毛剂进一步脱去毛发。同法处理右下肢足背趾蹼处皮肤，消毒后皮内注射10%亚甲蓝注射液0.5 ml。手术区消毒、铺无菌洞巾，在腹股沟远端约1 cm处取环形切口，游离、切除以远3 cm宽皮肤、皮下组织达肌肉，用手术刀搔刮创面彻底清除模型组织，清扫腹股沟区淋巴结，手术显微镜下分离与股部血管、神经伴行的深部淋巴管(已被亚甲蓝蓝染，见图1)，两端结扎，中间切除约4 cm。股部血管以附近肌肉覆盖，皮肤上、下端切缘内翻(至关重要)缝在肌肉上，外涂红霉素软膏，无菌包扎。术后每只兔子给予青霉素80万单位，静脉推注，连续3天。定期给予创面换药，使其瘢痕愈合。

图1 蓝染的股静脉周围淋巴管 图2 慢性淋巴水肿模型

1.3放射方法

3天后重新麻醉动物，固定于木质固定架上，右下肢略外展伸直，使用60Co照射仪，照射野为4 cm×3 cm，一次性给予2000 cGry剂量照射手术野。

1.4观察指标：

1.4.1肢体水肿体积 每周采用排水法(膝上1 cm)测量双下肢体积变化，计算出实验侧肢体与对照侧肢体体积的差值，即肢体水肿体积，各组时间点均从未处理前算起。

1.4.2水肿组织、瘢痕区和正常组织微淋巴管计数 6个月时取水肿组织、瘢痕区和对照侧肢体正常组织免疫组化法检测Flt-4，在高倍显微镜下计数染色的微淋巴管数目。每张染色玻片中选5个高倍镜视野，总数作为淋巴管计数。

1.4.3超声检查 急性水肿期及6个月慢性水肿模型形成后均用彩色多普勒检查右下肢，明确下肢动、静脉情况，除外深静脉血栓形成引起的肢体肿胀。

2 结 果

2.120只动物有1只因麻醉死亡，有1只动物因感染死亡，其余18只动物均在3天后开始出现肢体淋巴水肿，半月后达到高峰，5～6周时开始消退。3个月后，多数动物开始出现渐进性的肢体水肿，5个月后达高峰，此时形成稳定的淋巴水肿的兔为慢性淋巴水肿模型，共15只，除掉死亡动物，造模成功率为83%(15/18)。平均肢体水肿体积变化见图表1。

2.2水肿组织、瘢痕区和正常组织微淋巴管计数 (见表1)。

表1 各组微淋巴管计数

组别(n)微淋巴管计数( x±s)水肿组织(n=15)92.25±10.12瘢痕组织(n=15)39.99±5.7正常组织(n=15)66.97±7.13F=165.48P=0.0000

2.3超声检查 急性水肿期及慢性水肿模型形成后彩色多普勒检查未发现深静脉血栓形成，提示肢体肿胀不是因血管原因引起。

3 讨 论

肢体淋巴水肿模型的研究经历了百余年的漫长历史。1934年Drinker[1]等采用反复手术破坏狗的腹股沟淋巴管，并在淋巴管内注射硬化剂制造了慢性淋巴水肿模型。1967年Olszewiski[2]等采用环形切除皮肤、皮下软组织，切除淋巴管，方法制造狗后肢淋巴水肿模型，但是成功率较低。 1981年Suman[3]等报告了使用放射与手术相结合的方法制备狗肢体淋巴水肿模型，淋巴水肿发生率达100%。 1990年Mitchel[4]等利用手术与放疗相结合的方法制备了大鼠肢体淋巴水肿模型， 1999年Lee-Donaldson[5]等采用同法制备了大鼠肢体淋巴水肿模型，结果表明手术与放疗相结合造模可以产生中、重度淋巴水肿，且稳定而持久。孙沣等[6]应用传统的淋巴结根治与 60钴照射相结合的方法成功制作了兔后肢淋巴水肿模型，成活动物中淋巴水肿模型成功率达到100%。梁炳生等[7]比较了手术、放疗、先放疗后手术、先手术后放疗4种制作方法，发现手术与放疗相结合是一种造模的最好方法。

本实验的研究表明手术与放疗相结合造模成功率较高(83%)；而且术后加上放射更接近于乳癌术后、盆腔淋巴结清扫术后放射治疗后淋巴水肿的形成，作为此类疾病研究的动物模型，更具有说服力；一次性放射治疗减少了反复射线照射环节，简单方便，是一种较好的造模方式。根据实验动物肢体淋巴水肿体积的变化，了解到淋巴水肿形成的规律，模型制作术后3天开始出现肢体淋巴水肿，多数1月左右达到高峰，6周时开始消退。4个月后开始出现渐进性的肢体水肿，5个月后达高峰，此时出现稳定淋巴水肿的兔为慢性淋巴水肿模型。我们在预实验进行过程中发现，模型制作成功与否与操作的精细程度密切相关：其一环形切除皮肤后要彻底搔刮掉皮下肌间隙膜性组织；其二要彻底切断结扎股深部淋巴管，根据蓝染标记可见淋巴管环绕股静脉有多条分支并有多个交通支存在，术中均应彻底切除并结扎远近断端；其三缝合皮肤与肌肉务必内翻缝合，否则两端皮肤很快蔓延覆盖创面，形不成瘢痕愈合。另外，微淋巴管计数发现，瘢痕组织中微淋巴管明显减少，表明手术及放射很大程度上破坏了淋巴系统，导致远端阻塞性水肿；而水肿组织中微淋巴管则明显反应性增生，表明了一个机体自身代偿的过程，但此时的淋巴管系统是杂乱无章的，未形成有效的引流管道，但是由于管道总体横径增大，致使渗出增多，这在一定程度上更加重了淋巴水肿。

[1] Drinker CK ,Field ME ,et al. The experimental production of edema and elephantiasis as a result of lymphatic obstruction[J]. Amj Physiol, 1934, 108: 509.

[2] Olszewiski W，et al. Experimental lymphedema in dogs[J]. J Cardiovasc Surg (Torino), 1968, 9: 178.

[3] Sumen K, et al. A practical model of secondary lymphedema in the dog [J]. Plast Reconstr Surg,1981,6 8:4 22.

[4] Mitchel A, Kanter MD, et a1.An experimental model for chronic lymphedema[J]. Plast Reconstr Surg.,1990, 85: 575.

[5] Lee-donaldson L, Witte MH, Bernas M, et al. Refinement of a rodent model of peripheral lymphedema[J]. Lymphology, 1999,32:1 11-117.

[6] 孙沣，曹卫刚、李圣利，等.实验性兔后肢淋巴水肿模型构建[J].上海第二医科大学学报，2004，24(6)：426-431.

[7] 梁炳生,冯 勇,常文凯，等.慢性肢体淋巴水肿模型的比较研究[J].实用骨科杂志，2004, 10(3)：216-218.