单核细胞趋化蛋白-1启动基因多态性与狼疮肾炎相关性的研究*

武树朋 李 芳 王 静 张源潮

(1泰山医学院附属泰山医院风湿免疫科,山东 泰安 271000； 2.山东大学附属省立医院,山东 济南 250012 )

系统性红斑狼疮(SLE)是以引起抗体过度产生、补体异常活化、免疫复合物病理沉积、免疫功能持续紊乱为特征的多系统、多器官损害的自身免疫性疾病。单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein 1，MCP-1)是β类趋化因子，其功能为趋化白细胞及其它介质进入炎症部位[1]。位于MCP-1-2518部位的基因多态性影响转录的活性[2]。在狼疮肾炎(LN)活动期患者，位于肾小球和肾小管处MCP-1的表达数量是增加的，而其尿液MCP-1的水平也增加[3]。在本研究中，对于MCP-1 -2518位点基因多态性与SLE患者发生狼疮肾炎危险性进行了检测。

1 材料和方法

1.1研究对象 收集2005年6月～2006年2月在山东省立医院风湿免疫科门诊就诊或住院SLE患者72例，所有患者均符合美国风湿病学会1997年修订的SLE分类标准[4]。在确诊为SLE的基础上如有持续性蛋白尿>0.5 g/d或多次尿蛋白≥3+，或(和)细胞管型尿(可为红细胞、血红蛋白、颗粒或混合管型)，则可诊断为狼疮肾炎[5]。根据SLE疾病活动指数(systemic lupus erythematosus disease activity index, SLEDAI)来评价患者的病情活动性[6]。健康对照组为来自山东省立医院健康查体中心健康体检者59例。

1.2研究方法

1.2.1外周血基因组DNA提取 从经过EDTA处理全血中获得的外周白细胞抽提基因组DNA,该过程按照外周血基因组DNA抽提试剂盒操作说明进行。DNA抽提试剂盒购自上海申能博彩生物科技有限公司。

1.2.2聚合酶链反应(PCR) 查阅相关文献及与GeneBank核对序列，设计合成MCP-1启动基因PCR反应引物[7]，由上海生工生物工程技术服务公司合成。序列如下： 正向引物 5’-CCGAGATGTTCCCAGCACAGC-3’，反向引物 5’-CTGCTTTGCTTGTGCCTCTT-3’ 。PCR反应条件：94℃预变性3 min，然后94℃1 min、55℃1 min、72℃1.5 min循环35次，随后在72℃延伸10 min。PCR反应试剂购自宝生物工程公司。

1.2.3限制性片段长度多态性分析(RFLP) 扩增产物经PvuII限制性内切酶(晶美生物工程公司)在37℃消化16 h。酶切产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，经凝胶显像系统显像并分析结果。

1.2.4基因型的判定 含有单一930 bp片段的样本基因型为A/A，含有930、708、222 bp三种片段的样本基因型为A/G，含有708、222 bp两种片段的样本基因型为G/G。

1.2.5统计学处理 应用SPSS13.0统计软件进行统计分析。计量资料用均数±标准差表示。组间比较采用t检验。计数资料用相对数表示，组间比较采用χ2检验。以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1实验组与对照组的均衡性检验(表1) 纳入本研究的SLE患者组72例，其中女性65例，男性7例，年龄(33.50±12.39)岁；对照组59例，其中女性53例，男性6例，年龄(33.20±11.68)岁。两组性别构成、年龄构成经χ2检验无显著性差异(P=0.932、P=0.840)，两组平均年龄经t检验显示无显著性差异(P=0.889)，表明本研究SLE患者组及对照组在性别及年龄上具有可比性。

2.2MCP-1 -2518位点基因突变PCR-RFLP电泳结果(图1) 野生型(A/A)不被限制性内切酶PvuII所酶切，显示为930bp一条带；同源突变型(G/G)被PvuII酶切为708、222bp两片段，显示为两条带；杂合突变型(A/G)被PvuII酶切为930、708、222bp三片段，显示为三条带。

表1 两组研究对象的临床资料分析

图1 MCP-1-2518酶切产物琼脂糖凝胶电泳图

2.3MCP-1-2518位点基因型在SLE患者组及对照组中的分布(表2) 对照组A/A型基因型频率显著高于SLE患者组(P=0.001)。A/G型(P=0.024) 和G/G型(P=0.020)多见于SLE患者。

2.4MCP-1-2518位点基因型在狼疮肾炎及无狼疮肾炎SLE患者中的分布(表3) 与无狼疮肾炎SLE患者相比，患狼疮肾炎的SLE患者较常见基因型为A/G(P=0.024) 和G/G(P=0.015)。

表2 MCP-1-2518位点基因型在两组中的分布

表3 MCP-1-2518位点基因型在SLE患者中的分布

3 讨 论

SLE是由于遗传、激素、环境等多因素相互作用引起机体免疫调节紊乱所致的一种自身免疫性疾病。自Biett 1882年最早描述SLE至今，其病因及发病机制尚未完全清楚。近年来,自从趋化因子受体被发现作为HIV感染的协同受体后[8],趋化因子研究领域引起广泛的关注。而有研究[9]表明,HIV感染与SLE的免疫学以及临床上有很大的相似。这就很自然的使人联想到,与HIV感染有关的化学趋化因子可能与SLE发病或临床有关。

MCP-1 是由内皮细胞(endothelial cell, EC) 、血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCS)和单核细胞(monocytes,MCS) / 巨噬细胞分泌的一种趋化因子,属于趋化因子超家族。多种类型细胞包括血管内皮细胞、肾小球系膜细胞和巨噬细胞均可接受炎症细胞因子例如IL-1 、TNF-α和IFN-γ和免疫复合物的刺激而表达MCP-1[10]。MCP-1 不仅是一种单核细胞趋化因子,在单核细胞上有MCP-1 的高度特异性受体[11],而且可以趋化T 淋巴细胞,MCP-1 趋化的T淋巴细胞表现型为记忆型, 产生应答的细胞目前发现:CD45RA-,CD45RO+,CD8+[12],MCP-1 能呈剂量依赖性诱导人外周血MC 表达组织因子[13]。MCP-1 能诱导血管平滑肌细胞、内皮细胞表达粘附分子,粘附分子可促进单核细胞对内皮细胞的粘附并向内皮下迁移。MCP-1 能诱导白介素的表达[14]。MCP-1 还能诱导单核细胞钙离子内流,引起呼吸爆发、氧自由基的大量释放,导致血管内皮细胞损伤。细胞内外钙离子浓度也能影响单核细胞向内皮下迁移。因此,MCP-1 对单核细胞内皮下的募集起到启动和放大作用。

MCP-1多态性在SLE的作用已经有许多研究者予以检测，但却得出不同的结论。本研究显示MCP-1-2518位点基因型为A/G或G/G型的SLE患者有患狼疮肾炎的3～6倍高危险性，而基因型为A/A 型的SLE患者则具有较低的患狼疮肾炎的危险性。该研究得出的结论与美国研究人员Marco Tucci等[7]报道一致。然而，西班牙研究人员对SLE病人的检测，A/G基因型与血管炎的发生有关，但与狼疮肾炎的发生发展无关联性[15]，很可能是该研究中研究样本的民族组成与我们研究的不同导致的。韩国人Kim HL等[16]的研究发现A/A基因型的SLE病人具有较高的尿MCP-1水平，而且该基因型的狼疮肾炎病人具有较差的预后，而所有其他研究人员对于MCP-1 -2518位点基因多态性的检测显示A/G或G/G基因型的被研究者具有较高的血或尿MCP-1水平，只能推测在韩国人群中还有其他的基因突变影响MCP-1。Tucci M等[17]的研究发现，台湾地区儿童群体系统性红斑狼疮的发生发展与 MCP-1-2518基因突变不存在相关性，而与同为CC类趋化因子的RANTES(reduced upon activation,normal T expressed secreted;正常T细胞表达、分泌、活化时表达下降的因子)存在相关性。为进一步确证MCP-1-2518位点基因多态性在SLE 发病中的作用还应扩大样本量,从不同的实验角度论证。

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