L-精氨酸合成及高产菌选育与发酵研究进展

于向鹏，刘静，刘洁，金海如

(浙江师范大学化学与生命科学学院，浙江金华321004)

1929年广田氏研究鱼精蛋白发现其含大量精氨酸，约占总氨基酸的80%，因此命名为精氨酸(arginine，Arg)，精氨酸最初是在羽扇豆苗提取物中得到的［1］。精氨酸是一种人体半必需的碱性氨基酸，具有特殊的生理生化功能，被广泛应用于食品及医药工业中［2］。精氨酸不仅对氨中毒性肝昏迷、病毒性肝炎的治疗效果显著［3］，还通过精氨酸-一氧化氮通路所产生的一氧化氮，调节一系列免疫过程，对肌体起着全方位的保护作用［4］。创伤后肌体补充适当的外源L-精氨酸，可以促进伤口愈合，提高免疫水平［5］。此外，研究表明L-精氨酸在男性生殖功能中起到作用［6］，也有抗粥样动脉硬化、调节血压的功能［7-8］。在生化方面，精氨酸是尿素循环及合成聚胺、肌酸的代谢中间物，也是合成胞浆蛋白与核蛋白的前体。目前精氨酸最高产量为96 g/L［9］。国内菌株产酸水平和遗传稳定性依然处于劣势，且使用菌种单一，易被噬菌体污染。在重点综述真菌合成精氨酸研究进展基础上，对精氨酸发酵前景做了探讨，并根据实际情况提出了新的建议，为筛选高产精氨酸菌株提供新的解决途径。

1 精氨酸高产菌选育及发酵研究进展

1.1 高产精氨酸菌株选育进展

自然界中产精氨酸的正常菌株代谢会维持在一个平衡的稳定状态，故菌株精氨酸产量低，不利于工业生产。必须打破合成途径的平衡状态，获得“不正常”的菌株，提高精氨酸产量。

精氨酸的合成是一条没有分支的途径，其关键酶受终产物精氨酸的反馈抑制，因此，传统选育以UV、NTG、DES等理化诱变剂处理优良的出发菌株，主要通过筛选具有精氨酸结构类似物抗性的变异菌株，解除精氨酸对合成途径的反馈调节，从而提高产量。也可以构建精氨酸工程菌获得优良菌株。这方面早期研究已有文献进行了详细的综述［10］。

最早有关利用基因工程手段育种的报道是滕亦等将含精氨酸生物合成酶系基因群及质粒pEArgl导入到宿主谷氨酸棒杆菌ATCC13032，哈库利棒杆菌ATCC13868及黄色短杆菌ATCC14067中，构建精氨酸工程菌。最近，Ikeda等［11］以3株谷氨酸棒杆菌突变株为出发菌株进行基因重组，获得高产精氨酸菌株。表明将ΔargR和argB26组合并导入野生型C.glutamicum中，可得到精氨酸高产菌株。来源于亮氨酸生产菌株的基因leuC456，能够提高氨基酸包括精氨酸操纵子的活性。

国内杨新平等［12］利用含有argA、sacC编码序列的pARG25的重组质粒和带标记的大肠埃希菌LGE-28中，构建成了产精氨酸的基因工程菌，使糖转化率超过40%，可产精氨酸30 g/L以上，且杂酸量很低。近两年，已利用钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)SYPA构建出多株精氨酸工程菌。饶志明等［13］将argH构建钝齿棒杆菌重组穿梭表达质粒pJC1-tacargH，并将其通过电击转化法转入C.crenatum SYPA中，分析其发酵产精氨酸，结果表明与出发菌株相比精氨酸产量提高了约14.2%，达40.9 g/L。最近，Xu等［14］对关键酶N-乙酰谷氨酸激酶(NAGK)的序列进行定点诱变，形成复合突变位点NAGKM3，进而将其转入Corynebacterium crenatum SYPA-CCB，构建Corynebacterium crenatum SYPA-CCBM3精氨酸工程菌，具有抗精氨酸反馈抑制的特性。测试该工程菌精氨酸产量可达45.6 g/L。Dou等［15］对钝齿棒杆菌突变株的双功能酶鸟氨酸乙酰基转移酶进行研究，并将其转入Corynebacterium crenatum SYPA5-5过表达，也使精氨酸产量得到提高。

1.2 精氨酸发酵工艺研究进展

改进发酵是提高精氨酸产量的另一种有效措施，在优化发酵工艺上，一方面是优化培养基配方，另一方面是优化发酵条件。如利用合适的软件设计优化方案，调节初始糖浓度及补加硫酸铵，改善供氧策略及添加前体物质［16］。黄继红等［17］针对生物发酵过程的复杂性，利用细胞分析仪研究了产精氨酸菌群细胞活性能，解决了原位监测的困难，为发酵工艺优化带来了便利。

2 真菌中精氨酸合成及调控研究

20世纪六七十年代国外以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)2种模式生物作为研究对象，对精氨酸合成做了广泛研究。真菌中精氨酸的合成过程一般可分为3个主要部分:由谷氨酸经一系列酶作用形成鸟氨酸，氨甲酰磷酸的合成，鸟氨酸与氨甲酰磷酸合成精氨酸。精氨酸合成途径见图1。

2.1 精氨酸的合成

2.1.1 鸟氨酸的合成在2种模式生物中，鸟氨酸的合成场所都是线粒体［18-19］。首先，乙酰-CoA的乙酰基在乙酰谷氨酸合成酶催化下转移给谷氨酸形成N-乙酰谷氨酸;然后，N-乙酰谷氨酸激酶和N-乙酰谷氨酰磷酸还原酶催化乙酰谷氨酸通过一个不稳定的磷酸化的中间物形成乙酰谷氨酸半醛，这2种酶由单一复合位点合成［20］;接着，由乙酰鸟氨酸氨基转移酶和乙酰鸟氨酸谷氨酸酰基转移酶催化释放出鸟氨酸，从而使N-乙酰谷氨酸得到再生。利用酰基转移酶催化再生N-乙酰谷氨酸要比N-乙酰谷氨酸合成酶催化谷氨酸生成N-乙酰谷氨酸节省能量，有利于菌体生长繁殖。

乙酰-CoA被转移给谷氨酸后，便在精氨酸合成途径中合成一系列的乙酰化的中间物，它们可被合成鸟氨酸的酶特异性识别而进入精氨酸途径，非乙酰化的会进入脯氨酸合成途径。

2.1.2 氨甲酰磷酸的合成这一步反应粗糙脉孢菌发生在线粒体中，酿酒酵母发生在细胞质内［21-23］。催化氨甲酰磷酸合成的酶在动物和真菌内发现了2种，它们由不同基因所编码［24］。一种特异性作用于精氨酸途径称为CPS-A，而另一种则特异性作用于嘧啶途径称为CPS-P。CPS-A利用氨基氮，2 mol三磷酸腺苷(ATP)Mg2+，碳酸氢盐合成氨甲酰磷酸、无机磷酸和ADP［25］。CPS-A包含1个大亚基和1个小亚基，由分开的基因编码。它们的功能也各不相同，小亚基分裂谷氨酸，为下一步获得酰胺态氮;大亚基完成其他的反应。酿酒酵母中精氨酸途径的氨甲酰磷酸合成酶的调控有2种机制。一种是对CPS-A特异的，受精氨酸调控。这种特异机制调控编码小亚基的基因cpaⅠ的表达。另一种是普遍的，它控制除精氨酸序列之外的许多氨基酸合成途径的酶。与特异调控途径相反，一般调控途径即调控cpaⅠ又调控cpaⅡ的表达［26］。

图1 粗糙脉胞菌中精氨酸合成途径Fig.1 The path of arginine biosynthetic pathway of Neurospora crassa

2.1.3 鸟氨酸与氨甲酰磷酸合成精氨酸这个过程需要3种酶:鸟氨酸氨甲酰基转移酶、精氨酸琥珀酸合成酶、精氨酸琥珀酸裂解酶。在粗糙脉孢菌中第1个酶位于线粒体内。在酿酒酵母中3种酶均位于细胞质内，所以线粒体中合成的鸟氨酸通过ARG-11基因编码的载体蛋白运输到胞质内与氨甲酰磷酸合成精氨酸［27］。

鸟氨酸氨甲酰基转移酶催化氨甲酰磷酸的氨甲酰基转移到鸟氨酸的δ-氨基上，生成瓜氨酸和无机磷酸。在精氨琥珀酸合成酶催化的反应中，瓜氨酸、ATP-Mg2+、天冬氨酸和酶形成四聚体，进而释放出AMP、PPi-Mg2+和精氨酸琥珀酸。在2种生物的细胞内，精氨酸对此酶均有抑制性［28］。精氨琥珀酸经一步裂解酶催化的可逆反应生成精氨酸和延胡索酸。

2.2 真菌中精氨酸代谢的调控

2.2.1 一般控制系统在酿酒酵母中存在一个由多种氨基酸调控相耦合的调控方式，它是由一种氨基酸缺乏引起的多重氨基酸合成路径中酶的去抑制复合调控系统。这种交叉路径调控被称作一般氨基酸控制。这种调控方式控制7种不同氨基酸合成路径中至少30种氨基酸的表达。一般控制是在粗糙脉孢菌中发现的，最初也称为交叉途径控制［29］，并且现在这个名字仍在使用。

一般控制系统依赖每个协同调节的结构基因上游的短的重复核苷酸序列—5'-TGACTC-3'［30］。此序列的功能是正调控位点并且是GCN4蛋白的识别序列。GCN4的产物与特异序列5'-TGACTC-3'结合从而起作用。在酿酒酵母中，氨基酸缺乏时GCN1、GCN2、GCN3被激活，关闭GCD1，GCN4的mRNA被翻译，产物GCN4蛋白刺激氨基酸合成基因表达。氨基酸缺乏或tRNA卸载是导致去抑制的信号。在粗糙脉孢菌中起到类似GCN1、GCN2、GCN3作用的是CPC-1。在许多被测序的精氨酸基因的5'端非编码区都发现了这个序列，并且都受一般氨基酸调控。

另外，一些负调控作用的GCD基因产物是维持氨基酸非缺乏条件时抑制所需要的。在一般控制中GCN4表达在翻译水平上受其他GCN和GCD顺式作用因子的调节。gcn－和gcd－调节突变的表型说明GCN+和GCD+基因分别编码受一般控制的结构基因的正负顺势作用因子。

2.2.2 精氨酸特异调控在酵母中，协调所有氨基酸合成的调控发生在转录水平，而精氨酸特异调控发生在转录后水平。酿酒酵母中涉及到精氨酸合成与分解的基因的表达由特异的多功能因子调控，它们根据氨基酸、氮源、精氨酸的有无或作为激活剂或作为抑制剂。4种蛋白(Arg80、Arg81、Mcm1和ARG82)通过对精氨酸的应激，抑制合成基因和诱导分解基因，从而协调精氨酸代谢基因的表达。Arg80、Arg81、Mcm1形成一个复合蛋白［31］，与存在于精氨酸协同调控基因的启动子中被称作精氨酸盒的DNA序列相互作用。只有精氨酸与Arg81结合，复合体才能与DNA序列相互作用。其中ARG82的作用是固定Arg80及Mcm1蛋白，Arg81起到传感器的作用。另外，只要有外部氮源，分解代谢基因CAR1和CAR2的表达就被抑制，这是由带有组蛋白脱乙酰酶活性的复合体Ume6-Sin3-Rpd3调控的［32］。当细胞的生长环境缺乏氮源时，CAR1将被激活。

在粗糙脉胞菌中，存在精氨酸特异性翻译调控，它具有阻遏作用。arg-2上游开放阅读框架(uORF)在调控中起关键作用，粗糙脉胞菌转录物包含一个指定21个残基的导肽的上游开放阅读框架。精氨酸可增加核糖体延宕，从而减少从下游起始密码子的翻译［33］。

2.3 真菌产精氨酸研究

李兆兰等［34］分别测定7种真菌菌丝及发酵液中17种氨基酸的含量，多数真菌中精氨酸产量都很高，其中硫黄菌发酵液中精氨酸含量最高，而裂褶菌菌丝中精氨酸含量最高，可达1.69 g/100 g菌丝体。最近田萌萌等［35］以大葱(Allium fistulosum)为宿主植物，接种丛枝菌根(Arbuscular mycorrhizal，AM)真菌Glomus intraradices，经过试验处理，通过测定根外菌丝(Extraradical mycelium，ERM)和菌根中精氨酸的含量，探究葡萄糖、根浸出液对AM真菌吸收不同形式外源氮产生精氨酸的影响，其中以精氨酸为外源氮时，菌根中精氨酸产量可达4.29 mg/g菌丝体。进一步研究不同菌根真菌的精氨酸产量发现以聚丛球囊霉菌最高，为2.33 mg/g菌根，而根内球囊霉的根外菌丝精氨酸产量最高，为1.36 mg/g根外菌丝。

3 结论

据统计2007年欧美及日本的精氨酸总产量14 000 t，而我国制剂药用L-精氨酸产量为1 585 t，预计2012年将达到3 300 t，如此巨大增长的需求量主要依靠发酵法生产来满足。优良的精氨酸高产菌株是发酵工业应用的基础，因此选育高产菌是研究的重点。目前，精氨酸发酵生产遇到了难以获得优良菌株的瓶颈，传统选育手段已很难满足当前的趋势。也有人提出利用基因工程技术删除涉及精氨酸分解的ast操作子或者参与精氨酸摄入的argT和artU 2个基因，或者增加帮助精氨酸分泌的argO的表达的建议。国内也做了很多构建工程菌的研究，目前产量仍然未达到工业应用水平。近些年真菌资源已被广泛重视，很多真菌被应用于发酵生产，在产精氨酸菌种选育的研究中很少使用真菌，因此还可以考虑以真菌来选育高产精氨酸菌种。本实验室已经做了部分真菌发酵生产精氨酸的研究，在目前发酵条件下，其产量可达菌丝体干重的2%左右，且发酵液中也含一定量精氨酸。

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