60CO照射对豚鼠听力及耳蜗螺旋神经节细胞Caspase表达的影响*

谢利红 唐安洲 尹时华 谭颂华 孙贝蒂 钟华林

感音神经性聋是头颈部恶性肿瘤放射治疗后的常见并发症，影响患者的生存质量[1，2]。放疗导致感音神经性聋的机理仍不清楚，有学者认为，内耳细胞凋亡可能是感音神经性聋发生的细胞机理[3]。细胞凋亡的发生是一个非常复杂的过程，其启动受到精确调控。Caspase8、Caspase9、Caspase3是近年来发现的类半胱氨酸蛋白酶的重要家族成员，是细胞凋亡的重要蛋白[4]。本实验观察60CO照射后凋亡相关蛋白Caspase8、Caspase9、Caspase 3在耳蜗螺旋神经节细胞中的表达，旨在探讨60COγ射线对豚鼠听功能的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组 白化豚鼠40只，体重250～350 g(普通级)，购自湖南开福区东创科技服务部，雌雄不拘。随机分为放射组与对照组，对照组8只不实施60CO照射；放射组32只，以右耳为照射耳，于60CO照射后第1、4、7、14天行ABR检查后，每个时间点各处死8只豚鼠，行耳蜗HE染色及免疫组织化学染色。

1.260CO照射方法 放射组豚鼠用1%戊巴比妥钠(3.5 μl/g)麻醉固定后，用GWXJ80型60CO远距离治疗机(中国核动力研究设计院设备制造厂)对豚鼠右耳耳颞部行一次性60CO照射70 Gy，辐射深度2.0 cm，照射范围为2 cm×2 cm，源皮距80 cm，自制铅板遮盖非照射部位。

1.3ABR反应阈检测 采用美国尼高力VikingQuest进行测试，豚鼠麻醉后置于俯卧位，刺激声选择短声，重复率11.4次/秒，平均叠加次数512次，扫描时间10 ms，滤波带宽0.15～3.00 kHz。记录电极位于豚鼠颅顶，参考电极位于耳垂，地极接鼻尖。把可引出波III的最低刺激强度确定为阈值。

1.4石蜡标本制备与HE染色 断头经腹侧取豚鼠听泡，暴露耳蜗并在蜗尖钻孔，推镫骨底板脱位，刺破圆窗膜，用4%多聚甲醛固定液灌流固定后，再放入固定液4 ℃固定24 h以上。用10%EDTA脱钙10～14 d，酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，耳蜗中轴切片。石蜡切片脱蜡和水化，苏木精染色10 min，1%盐酸酒精分色，自来水蓝化，0.5%伊红染色1 min，酒精脱水，透明，封片。

1.5免疫组织化学染色 石蜡切片脱蜡和水化，pH 6.0的0.01 mol/L的柠檬酸盐缓冲液煮沸热修复抗原10 min，3%H2O2室温孵育15 min，非免疫血清封闭10 min，加一抗Caspase3(1:500)、Caspase8(1：200)、Caspase9(1:600)4℃ 6 h，加二抗，室温下孵育10 min，加三抗室温下孵育10 min，DAB显色，苏木素复染，中性树胶封片。阴性对照切片用PBS 代替一抗，其他实验步骤不变。Caspase的阳性表达为细胞浆的棕黄色染色。通过IPP6图像分析软件计算其平均光密度值。

1.6统计学方法 所有结果通过SPSS 13.0统计软件进行分析，采用单因素方差分析进行比较。

2 结果

放射组豚鼠60CO照射后第1、4、7天所有豚鼠听泡内无积液及脓性分泌物，第14天少数豚鼠有中耳积液予以剔除(放射组中不包括剔除的豚鼠)。

2.1ABR反应阈 放射组豚鼠60CO照射后第4天ABR反应阈与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)，照射后第7、14天ABR反应阈与对照组比较差异有显著统计学意义(P<0.01)(表1)。

2.2HE染色结果 对照组豚鼠螺旋神经节细胞形态正常，无萎缩及缺失改变。而放射组豚鼠在照射后第4天出现较明显的SGC萎缩，表现为细胞浆减少、细胞核浓缩凝集，照射后第7、14天SGC萎缩更明显(图1)。

2.3SGC的免疫组织化学染色结果 放射组SGC的Caspase8、Caspase 9、Caspase 3在螺旋神经节细胞的表达上调，照射后第1天、4天、7天和14天SGC的Caspase 8的平均光密度值与对照组比较差异均有显著统计学意义(P<0.01)。照射后第4、7和14天SGC的Caspase 9的平均光密度值与对照组比较差异有显著统计学意义(P<0.01)。照射后第1、14天的Caspase 3平均光密度值与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)，照射后第4、7天的Caspase 3平均光密度值与对照组比较差异有显著统计学意义(P<0.01)(表1，图2)。

3 讨论

图2 两组豚鼠SGC免疫组织化学染色图片(×400)a 对照组SGC Caspase3无明显阳性表达；b 放射组SGC Caspase3有阳性表达；c 对照组SGC Caspase9无明显阳性表达；d 放射组SGC Caspase9有阳性表达；e 对照组SGC Caspase8无明显阳性表达，f 放疗组SGC Caspase8有阳性表达

表1 放射后各组与对照组豚鼠ABR反应阈及SGC Caspase9、Caspase3、Caspase8的平均光密度值比较

注：与对照组比较；*P<0.05，**P<0.01

头颈部肿瘤放射治疗常用的放射线如电子射线、β射线、γ射线以及快中子射线等均能引起听觉系统的损伤，放射治疗后引起的感音神经性聋呈显著的剂量相关性[5]。在电离辐射引起内耳损伤的动物实验研究中发现，单次照射40 Gy并不明显引起听力变化[6]，多次分割照射(每天一次2 Gy，每周5次)大于50 Gy时才可引起听力的改变[7，8]。李荧等[9]报道给予豚鼠70 Gy照射后第3天行ABR测试，结果显示听力损失以轻中度为主，到第2周后出现中重度听力损失。本研究采用一次性给予豚鼠耳颞部70 Gy剂量60CO照射后第14天时豚鼠出现中度的听损伤，与其他学者的研究类似。

目前对于电离辐射首先损害耳蜗的哪一结构还不清楚，许多学者经动物研究发现，放疗可导致内耳螺旋器细胞形态学的改变[10，11]，放疗对Corti器的损伤中，外毛细胞损伤比内毛细胞损伤更严重。Gibb等[12]报道1例放射治疗后7年死亡的鼻咽癌患者颞骨组织病理报告显示，耳蜗Corti器内毛细胞无缺失，外毛细胞散在缺失，血管纹片状萎缩，有中重度耳蜗螺旋神经节细胞的缺失，认为放疗后螺旋神经节细胞的损害比Corti器更明显。本研究发现一次性给予70 Gy60CO射线照射后，豚鼠早期(照射后第4天)即可出现较明显的耳蜗螺旋神经节细胞的萎缩改变。本研究只观察了放射后14天以内螺旋神经节细胞的损伤，在今后进一步的研究工作中，可延长观察时程，同时观察螺旋神经细胞以及毛细胞放射线照射后的改变，以了解其对放射是否有不同的反应。

Caspase 8是死亡受体凋亡途径中的重要启动因子，Caspase 9是线粒体凋亡途径中的重要启动子，Caspase 8、Caspase 9的启动活化均可以促进Caspase3的活化，从而产生了蛋白水解作用形成的Caspase自我放大级联反应，进而裂解DNA损伤细胞[13]，引起细胞程序性死亡[14]。本研究结果表明60CO照射导致了豚鼠螺旋神经节细胞Caspase8、Caspase9、Caspase3蛋白的表达上调，螺旋神经节细胞发生萎缩改变，说明60CO γ射线照射致豚鼠ABR反应阈上升可能与耳蜗螺旋神经节细胞的萎缩有关，而螺旋神经节的萎缩可能与Caspase 8、Caspase9、Caspase3在螺旋神经节细胞的表达上调有关。

4 参考文献

1 Yilmaz YF， Aytas FI, Akdogan O,et al. Sensorineural hearing loss after radiotherapy for head and neck tumors[J]. Otology Neurotol,2008,29:461.

2 Schultz C, Goffi-Gomez MV,Pecora Liberman PH,et al.Hearing loss and complaint in patients with head and neck cancer treated with radiotherapy[J]. Arch Otolaryngol Head Neck Surg, 2010,136:1 065.

3 何子毅，孟庆勇.电离辐射与细胞凋亡[J].国外医学放射医学核医学分册，2004(28)：90.

4 Rastogi RP,Sinha E,Sinha RP. Apoptosis: molecular mechanisms and pathogenicity[J]. EXCLL,2009,8:155.

5 Akmansu H, Eryilmaz A, Korkmaz H, et al. Ultrastructural and electrophysiologic changes of rat cochlea after irradiation[J]. Laryngoscope, 2004,114:1 276.

6 王家东，丁大连，金西铭，等.一次性大剂量60钴辐射对豚鼠耳蜗影响的实验研究[J].听力学及言语疾病杂志，1999,7：141.

7 杨新明，卢永德，陈忠，等.电离辐射对内耳的迟发性损害[J].临床耳鼻咽喉科杂志，1997,32：222.

8 崔广帅，金大玉，邢巍巍，等.电离辐射对听功能影响的实验研究[J]. 听力学及言语疾病杂志，2010,18:65.

9 李荧，郭广威，苏纪平.经圆窗膜给地塞米松改善放射致豚鼠内耳损害的研究[J].中华放射医学与防护杂志,2009,29：590.

10 金大玉,崔广帅，邢巍巍，等.电离辐射对耳蜗超微结构的影响[J].听力学及言语疾病杂志，2010,18：496.

11 邢巍巍，王雪峰，金大玉.山莨菪碱对耳蜗电离辐射损伤防护作用的实验研究[J].中华放射医学与防护杂志，2010,30：426.

12 Gibb AC,Loh KS.The role of radiation in delayed hearing loss inmairment in nasopharyngeal carcinoma[J].J Laryngol Otol, 2000,114:139.

13 Labbe D,Teranishi MA,Hess A,et al.Activation of caspase-3 is associated with oxidative stress in the hydropic guinea pig cochlea[J].Hear Res,2005,202:21.

14 李光明，谢青，周霞.线粒体细胞色素C与细胞凋亡[J].国外医学流行病学传染病学分册，2003,30：26.