心肌缺血期应用环孢素A对大鼠心肌功能的影响

刘勇 殷桂林 朱水波 王荣平 孙宗全

[摘要] 目的：通过大鼠心肌缺血期应用线粒体通透性转换孔（mPTP）抑制剂环孢素A（CsA），观察其心肌保护能力，探讨该方式诱导大鼠心肌保护的可行性。方法：42只健康雄性Wistar大鼠经胸骨下段切口暴露心脏，打活结的方式结扎冠状动脉左前降支（LAD），建立在体心肌缺血/再灌注损伤模型。①Sham组（n=8）：将缝线穿过LAD下方，但不结扎。②缺血/再灌注组（IR组，n=12）：心脏LAD实施30 min缺血/180 min再灌注处理；③心肌缺血期短暂肢体缺血处理组（RP组，n=12）：心脏LAD实施30 min缺血/180 min再灌注处理；在实施心肌缺血期间对双下肢实施3次5 min缺血/5 min再灌注；④环孢素A组（CS组，n=10）：心脏LAD实施30 min缺血/180 min再灌注处理；心肌缺血期间经心脏测压管注射CsA 10 mg/kg。计算缺血期心律失常（ischemia arrhythmia，IA）及再灌注性心律失常（reperfusion arrhythmia，RA）评分；比较左心室发展压（LVDP）、左心室压上升/下降最大速率（±dp/dtmax）；HE染色观察心肌组织形态，TTC染色法测定心肌梗死面积。结果：CS组与RP组再灌注早期RA评分均低于IR组（P=0.045、0.023），但CS组与RP组比较差异无统计学意义（P>0.05）。CS组再灌注30、60、120、180 min时，LVSPmax（P=0.033、0.001、0、0）和再灌注120、180 min时±dp/dtmax（P=0.046/0.020和P=0.015/0.025）显著低于IR组。CS组再灌注60、120、180 min时，LVSPmax（P=0.012、0、0）、再灌注60 min时-dp/dtmax（P=0.026）及再灌注180 min时±dp/dtmax显著低于RP组（P=0.014/0.012）。HE染色发现CS组存在严重心肌组织水肿。CS组心梗范围介于RP、IR组之间，RP组心梗范围显著小于IR组（P=0.001）、CS组（P=0.043），CS组显著小于IR组（P=0.026）。结论：心肌缺血期心腔注射CsA通过抑制mPTP的开放，减少RA，其效果与RP相当，但同时存在对心肌的严重副损伤。针对CsA和心肌mPTP的研究可能对心肌保护产生积极影响。

[关键词] 缺血/再灌注损伤；心肌保护；线粒体通透性转换孔；环孢素A；大鼠

[中图分类号] R982；R453[文献标识码]A [文章编号]1673-7210（2011）11（c）-015-04

Effect on rats′ myocardial function induced by Cyclosporine A during myocardial ischemic period

LIU Yong1, YIN Guilin1, ZHU Shuibo1, WANG Rongping1, SUN Zongquan2

1.Department of Cardiothoracic Surgery, Wuhan General Hospital of Guangzhou military Command, Hubei Province, Wuhan 430070, China; 2.Department of Cardiac Surgery, Union Hospital Affiliate to Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology, Hubei Province, Wuhan 430022, China

[Abstract] Objective: To study the capability of myocardial protection of Cyclosporin A, the inhibitor of mitochondrial permeability transition pore (mPTP) applied during myocardial ischemic period of rats, and to discuss the feasibility of that method. Methods: Healthy male Wistar rats were administered. The heart was exposed through lower sternal incision and the left anterior descending coronary artery was ligated by slipknot to establish the ischemia/reperfusion model. 42 rats were assigned randomly into four groups. ①Sham group (n=8): rats were threaded a silk suture under the left coronary artery anterior descending (LAD) and laid up throughout the experiment. ②IR group (ischemial reperfusion group) (n=12): rats were subjected to 30 min LAD occlusion followed by 180 min reperfusion. ③RP group (transient limb ischemic conditioning during myocardial ischemia period, remote perconditioning group) (n=12): rats were subjected to three episodes of 5 min double hind limbs occlusion followed by 5 min reperfusion during 30 min myocardial ischemia period which followed by 180 min reperfusion. ④CS group (Cyclosporine A group) (n=10): rats were subjected to 30 min LAD occlusion followed by 180 min reperfusion while CsA was injected into the left ventricle from the catheter dosed with 10 mg/kg. The scores of ischemia arrhythmia and reperfusion arrhythmia, the left ventricular developing pressure, the maximal change index of LV (±dp/dtmax) were calculated. The myocardial morphology was observed by HE staining. Myocardial infarct size was measured by TTC staining technique. Results: RA scores of CS group and RP group were lower significantly than IR group (P=0.045, 0.023), while no significant difference was found compared to RP group. Compared to IR group, LVSPmax was lower significantly at reperfusion time of 30, 60, 120 and 180 min (P=0.033, 0.001, 0, 0); ±dp/dtmax was lower significantly at reperfusion time of 120 and 180 min (P=0.046/0.020 and P=0.015/0.025). Compared to RP group, LVSPmax was lower at reperfusion time of 60, 120 and 180 min (P=0.012, 0, 0); -dp/dtmax at reperfusion time of 60 min and ±dp/dtmax at reperfusion time of 180 min were lower significantly (P=0.026, and P=0.014/0.012). Severe myocardial edema was found in CS group. The infarct size of CS group fell in between RP group and IR group. The infarct size of RP group was significantly smaller than that of IR group (P=0.001) and CS group (P=0.043) while the difference of infarct size between CS and IR group was statistically significant (P=0.026). Conclusion: CsA which injected into heart chamber during myocardial ischemic period can inhibit open of mPTP and reduce RA. The effect is similar to the method of remote conditioning by transient limb ischemia, but it can induce severe side injury. Research aiming at CsA and myocardial mPTP may generate positive impact on myocardial protection.

[Key words] Ischemia/reperfusion injury; Myocardial protection; Mitochondrial permeability transition pore (mPTP); Cyclosporin A; Rats

在大鼠心肌缺血期进行短暂双下肢缺血处理（remote conditioning，RP）可以减少再灌注性心律失常（reperfusion arrhythmia，RA）[1]、减少心肌梗死。线粒体是心肌细胞的生死之门，线粒体通透性转换孔（mitochondrial permeability transition pore，mPTP）是非选择性极高的线粒体内膜通道，是心肌细胞致死性再灌注损伤的决定性因素，也是心肌保护的最新靶点[2]。通过大鼠冠状动脉结扎模型发现采用预处理方式应用mPTP开放抑制剂环孢素A（CsA），能够通过和线粒体基质的亲环蛋白D（cyclophilin D，CyP-D）结合抑制mPTP开放，在再灌注过程中发挥心肌保护作用[3]。本实验采用心肌缺血期应用CsA，评价其心肌保护能力，探讨心肌缺血期应用CsA抑制mPTP开放对心肌的可行性。

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂

成年健康雄性Wistar大鼠42只，体质量250~410 g，平均（340±59）g，购自湖北省疾病预防控制中心。水合氯醛为国产化学纯；Evan′s Blue及氯化三苯四氮唑（tetrazolium，TTC）购自美国Sigma公司；CsA购自北京双鹭药业股份有限公司，250 mg/5 ml，以生理盐水稀释为10 mg/ml。啮齿动物人工呼吸机DH-150，浙江大学医学仪器厂；Powerlab 16道生理记录仪、压力及生物放大器、1050.1型压力换能器，澳大利亚AD Instrument公司。

1.2 动物模型制备及分组

大鼠称重，10％水合氯醛（0.3 ml/100 g）腹腔注射麻醉，气管切开，随后插入16 G套管针（直径2 mm），连接动物人工呼吸机进行机械通气，通气量3~4 ml/100 g，通气频率60次/min，吸呼比1∶1，不需连接输氧装置。沿胸骨纵行切开皮肤，沿胸骨正中剪开至第3前肋水平。在左心耳根部下方2~3 mm处以心脏表面左冠状静脉主干为标志，用5-0无创缝合针穿过心肌表层，在肺动脉圆锥旁出针。结扎30 min后松结扎线，持续观察180 min建立模型。①Sham组（n=8）：将缝线穿过左冠脉前降支下方，但不结扎。②IR组（n=12）：结扎30 min，再灌180 min。③RP组（n=12）：心脏操作同IR组，在心肌缺血起始时捆绑双下肢5 min，以肢体远端发紫，不能触及股动脉搏动为准，松开5 min，反复3次。④环孢素A组（CS组，n=10）：心脏操作同IR组，心肌缺血期，经心腔测压管一次性注入CsA 10 mg/kg[4]。持续心电监测，经心腔测压管监测左心室压力变化[5]。

1.3 标本处理

实验终点行Evan′s blue染色，Sham组5只，IR组6只、RP组7只、CS组5只进行染色处理。实验终点，冠状动脉结扎点原位结扎，经心腔测压管注射2%Evan′s blue约为2.5 ml，适当夹闭主动脉根部，以促进Evan′s blue进入冠状动脉内，待球结膜蓝染后，心腔注射10%KCl 0.1 ml，使心脏停跳于舒张期，然后切取心脏。冰生理盐水冲洗后，去除心底大血管，左、右心房及右心室，入-80℃冻存待检。未行Evan′s blue染色的标本取心脏穿线部位与心尖之间的中上2/3的左心室前壁心肌组织以4%甲醛固定，24 h后行常规石蜡包埋，备用。

1.4 检测指标

1.4.1 再灌注性心律失常的判断与评分观察记录心肌缺血期及再灌注期间出现的室性心律失常情况并计分，评分参考Curtis等[6]报道的评分规则。具体如下：0分，无心律失常；1分，偶发性室性早搏（1 min 内发生3次以下的室性早搏）；2分，频发性室性早搏（1 min内发生3次或3 次以上的室性早搏）；3分，偶发性室性心动过速（1 min内发生3次以下的室性心动过速）；4分，频发性室性心动过速（1 min内发生3次或3次以上的室性心动过速）或偶发性室颤（1 min内发生3次以下的室颤）；5分，频发性室颤（1 min内发生3次或3次以上的室颤）或死亡。

1.4.2 血流动力学变化监测记录左心室最大收缩压（LVSPmax），左心室压力上升/下降最大速率（±dp/dtmax）。

1.4.3 心肌HE染色比较四组各取5个未进行Evan′s blue染色的心脏标本，经4%甲醛固定后，常规石腊包埋，制作光镜切片，观察心脏组织学改变。

1.4.4 心肌梗死范围染色比较取染色心脏标本自然升温到0℃左右时，从心尖部向心底部横向切成1~2 mm厚度薄片4~6片，放入1%TTC PBS中（pH=7.40）37℃孵育20 min。用蒸馏水中止反应，将切片浸入4%的甲醛中24 h增强颜色对比。存活心肌呈砖红色，梗死区不着色呈灰白色，把心肌片用水冲去多余的染料，并排置于滤纸上吸干水分，放在两玻片间夹持固定，以固定焦距数码相机拍摄各切片图象，用Photoshop 8.01软件分析心肌缺血范围及心肌梗死范围。心肌缺血范围（%）=心肌缺血范围/心肌片面积之和×100%，心肌梗死面积（%）=（梗死面积之和/心肌缺血范围）×100%。其中Sham组因无明显心肌梗死范围，不便图像分析，不进行心肌梗死范围比较。

1.5 统计学方法

采用SPSS 13.0软件包进行统计处理。计量数据以均数±标准差（x±s）表示，多组间数据以one-way ANOVA进行分析，两组间按独立样本非参数t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 心律失常的评分与比较

缺血期，Sham组受心脏手术操作干扰，出现少许室性心律失常，以室性早搏为主。其余组均出现室性心律失常，以室性心动过速和室早二、三联律为常见，偶见室颤。CS组缺血期心律失常评分低于IR组及RP组，但差异无统计学意义（P=0.099、0.133）。再灌注期，在再灌注前30 min IR组以室性早搏二联律及短阵室速为主，RP、CS组以偶发室性早搏及二联律多见。CS组与IR组比较差异有统计学意义（P=0.045）；CS组与RP组间比较，差异无统计学意义（P=0.983）；RP组与IR组间比较差异有统计学意义（P=0.023）；随时间延长，心律失常减少至消失，后期各组间评分比较差异均无统计学意义（P>0.05）。见图1。

2.2 血流动力学的变化情况

各组与Sham组比较发现，IR组再灌注0 min时，LVSPmax显著降低（P=0.004）；再灌注30、60 min-dp/dtmax显著降低（P=0.015、0.011）。RP组再灌注60 min时+dp/dtmax显著降低（P=0.045）。CS组再灌注0~180 min时，LVSPmax（P=0.040、0.004、0.006、0.001、0）和±dp/dtmax显著低于Sham组（P=0.045、0.022和P=0.002、0.004）。

CS组与IR组比较发现，再灌注30、60、120、180 min时，LVSPmax（P=0.033、0.001、0、0）显著降低。再灌注120、180 min时±dp/dtmax（P=0.046、0.020和P=0.015、0.025）显著降低。

CS组与RP组比较发现，再灌注60、120、180 min时，LVSPmax（P=0.012、0、0）显著降低。再灌注60 min时-dp/dtmax（P=0.026）、再灌注180 min时±dp/dtmax低于RP组（P=0.014/0.012）。见表1。

2.3 心肌HE染色比较

Sham组见轻度间质出血，心肌略水肿。IR组、RP组均可见心肌组织水肿、间质出血，炎症细胞浸润、少数心肌细胞变性坏死等。IR心肌全层均有坏死表现，心外膜下心肌水肿，RP组心肌组织的水肿、炎症细胞浸润等病理改变均较IR组有所减轻。CS组除上述表现为还存在严重心肌组织水肿，部分心肌横纹消失。见图2。

2.4 心梗范围的计算

四组分别有5、6、7、5只大鼠心脏标本进行心肌缺血范围及心梗范围计算。各组大鼠体重及左室心肌危险区域（缺血范围）比较，差异均无统计学意义（均P>0.05）。RP组心梗范围显著小于IR组（P=0.001）、CS组（P=0.043），CS组显著小于IR组（P=0.026），差异均有统计学意义。见图3。

3 讨论

mPTP开放是心肌IRI的重要机制之一[7]。免疫抑制剂CsA作为mPTP特异性抑制剂，可以特异性结合在细胞内位于线粒体基质的结合蛋白CyP-D，由Ca2+触发后与ANT结合，抑制mPTP的开放。采用CsA预处理可以抑制线粒体通透性转换的发生，减轻心脏的再灌注损伤。

本实验发现，在心肌缺血期注射CsA后，与IR组比较，RA评分显著降低，心梗范围显著减小，但对心脏舒缩功能的有益作用不显著。与RP组比较发现，两种方式减少RA的作用相当，但心肌舒缩功能显著下降，心梗范围显著增大。说明CsA在心肌缺血期的应用具有一定的心肌保护作用，主要表现为可以减少RA的发生。

RA发生的根本原因是折返激动和触发活动，其电生理机制包括再灌流重新形成折返通道，室颤阈值降低，心肌自律性增强等。应用CsA具有减少RA的作用，其机制可能有①Mg2+向细胞内转移抑制了心肌细胞的钙超载；②CsA通过抑制mPTP的开放，减少线粒体内Ca2+外流入胞浆，维持胞浆内钙稳定，减少了钙震荡，减轻RA的发生。

李扬等[8]发现，给予大鼠5.0、10.0、15.0 mg/kg腹腔注射CsA，随时间延长，各组均可见心肌细胞、间质及周围血管出现不同程度水肿，胞浆出现嗜酸性变，心肌细胞有空泡变。部分心肌横纹消失，有核浓缩、核凝固及心肌小灶状坏死，严重时有炎症细胞浸润。低剂量CsA对大鼠心肌组织和心功能无明显影响，而较大剂量组大鼠出现不同程度的心肌变性改变和心功能下降，均呈剂量与时间依赖性。电镜发现较大剂量CsA使心肌细胞内线粒体出现嵴内间隙肿胀甚至嵴断裂，并因此推测是CsA使NO大量生成，抵消了CsA作用于mPTP而对心肌细胞产生的有益作用。与本实验中CS组心肌也存在较明显水肿现象结果一致。据此推测，心腔直接注射CsA，其心脏毒性作用可能更快地作用于心肌细胞，导致心肌水肿和损害，使心室收缩和舒张功能受损。其机制可能是CsA持续抑制Ca2+从肌浆网或线粒体内释放，细胞器内Ca2+超载，线粒体严重损伤[9]同时伴有能量转换障碍，ATP减少，Na+-K+泵功能障碍，胞浆内Na+、水增多引起心肌水肿。这也可能是本实验中CsA仅模拟了RP减少RA等作用，而未能改善心肌舒缩功能的主要原因。

综上所述，心肌缺血期心腔注射CsA通过抑制mPTP的开放，减少RA，其效果与RP相当，但同时存在对心肌的严重副损伤。针对CsA和心肌mPTP的研究可能对心肌保护产生积极影响。

[参考文献]

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[2]Davidson SM, Hausenloy D, Duchen MR, et al. Signalling via the reperfusion injury signalling kinase (RISK) pathway links closure of the mitochondrial permeability transition pore to cardioprotection [J]. Int J Biochem Cell Biol,2006,38(3):414.

[3]Hausenloy DJ, Maddock HL, Baxter GF, et al. Inhibiting mitochondrial permeability transition pore opening: a new paradigm for myocardial preconditioning [J]. Cardiovasc Res,2002,55(3):534.

[4]Krolikowski JG, Bienengraeber M, Weihrauch D, et al. Inhibition of mitochondrial permeability transition enhances isoflurane-induced cardioprotection during early reperfusion: The role of mitochondrial katp channels [J]. Anesth Analg,2005,101(6):1590.

[5]刘勇,殷桂林,朱水波,等.胸骨下段切口制备大鼠心肌缺血/再灌注模型的评价[J].华南国防医学杂志,2010,24(2):126.

[6]Curtis MJ, Walker MJ. Quantification of arrhythmias using scoring systems: an examination of seven scores in an in vivo model of regional myocardial ischemia [J]. Cardiovasc Res,1988,22(9):656.

[7]Halestrap AP, Clarke SJ, Javadov SA. Mitochondrial permeability transition pore opening during myocardial reperfusion: a target for cardioprotection [J]. Cardiovasc Res,2004,61(3):372.

[8]李杨,于金凤,张朝颖,等.环孢霉素A诱导的心肌损伤与NO和NOS的关系[J].哈尔滨医科大学学报,2009,43(3):241.

[9]Sayen MR, Gustafsson AB, Sussman MA, et al. Calcineurin transgenic mice have mitochondrial dysfunction and elevated superoxide product ion [J]. Am J Physiol Cell Physiol,2003,284(2):C562.

（收稿日期：2011-10-17）