雷公藤多甙诱导SCID小鼠体内HL-60细胞凋亡的研究

唐加明 梁国华 陈晓昀 朱玉峰

中药雷公藤具有抗炎和免疫调节作用，常用于治疗自身免疫性疾病。文献报道雷公藤还有抗肿瘤作用[1]。我们体外研究显示雷公藤多甙对HL-60细胞有明显地诱导凋亡作用，表明雷公藤多甙在体外实验中具有抗白血病活性[2]。但是，在体外实验中具有抗肿瘤活性的药物在体内抗肿瘤效果并不确定。因此，本研究通过构建重度联合免疫缺陷(SCID)小鼠人HL-60细胞白血病模型，观察雷公藤多甙在体内对白血病细胞的作用。

1 材料与方法

1.1 细胞系

人急性髓系白血病HL-60细胞株，购自中国科学院上海细胞库。

1.2 实验动物及饲养环境

3～4周龄、雌性、SPF级SCID小鼠30只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。所有小鼠饲养于南方医科大学南方医院实验动物中心，小鼠在层流架内带盖鼠盒中饲养(符合 SPF标准)。

1.3 试剂与仪器

雷公藤多甙为上海医科大学红旗制药厂产品。TUNEL试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供。

1.4 细胞培养

HL-60细胞用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液，在37℃、5%CO2、饱和湿度条件下常规培养，每周换液2次。取指数生长期细胞进行移植。

1.5 SCID小鼠人HL-60细胞白血病模型的建立

SCID小鼠移植前未作任何处理。取体外培养的指数生长期的HL-60细胞用于移植，用生理盐水洗涤2次后，每只鼠从静脉接种3×106个细胞。

1.6 实验分组及给药方法

用生理盐水溶解雷公藤多甙。30只小鼠随机分为3组，每组10只：①雷公藤多甙组：于成功接种后第22天开始，每只小鼠腹腔注射雷公藤多甙1 mg/(kg·d)，终体积为0.2 ml/d×10天；②模型组：于成功接种后第22天开始，每只小鼠连续10天腹腔注射生理盐水0.2 ml/d；③空白组：未接种HL-60细胞，与上述两组同时开始腹腔注射等量生理盐水。

1.7 生存情况观察

记录各组小鼠的一般情况。白血病小鼠(模型组及雷公藤多甙组)的生存期从接种当日开始计算。

1.8 血象观察

剪尾采血，行白细胞计数。涂片，瑞氏染色，显微镜下观察细胞形态并分类。

1.9 脾脏病理及细胞凋亡检测

断颈处死小鼠，迅速取其脾脏，常规操作制成病理切片，观察病理形态改变。按照TUNEL试剂盒说明书进行操作，检测脾脏细胞凋亡情况。

1.10 统计学处理

2 结果

2.1 血象改变

经尾静脉接种HL-60细胞后第22天，20只SCID小鼠的外周血中均出现了与体外培养的HL-60细胞形态类似的白血病细胞见表1。给药10天后，与模型组比较，雷公藤多甙组外周血白细胞总数及白血病细胞数均明显减少(P<0.05)，见表2。

2.2 脾脏病理改变

病程后期，模型组小鼠脾脏中可见大量白血病细胞浸润。与模型组比较，雷公藤多甙组小鼠脾脏中白血病细胞浸润程度明显减轻。

2.3 脾脏细胞凋亡率

空白组小鼠脾脏内未见凋亡细胞。模型组细胞凋亡率为(7.2±1.5)%，雷公藤多甙组与模型组比较，细胞凋亡率明显增高(21.6±2.4)%，P<0.05。

2.4 生存期比较

与未接种HL-60细胞的小鼠相比，晚期白血病小鼠均有不同程度地体重下降、精神不振、食欲下降、懒动、行走不稳等表现。与模型组比较，雷公藤多甙组的一般情况较好，生存期明显延长[(38.2±4.1)d，(52.6±5.3)d]，P<0.05。

表1 SCID 小鼠接种HL -60细胞后血象变化(%)

表2 雷公藤多甙给药10天后白血病小鼠血象情况(%)

* 为与模型组比较，P<0.05

3 讨论

雷公藤多甙是卫矛科雷公藤根经去皮、提取而成的1种中成药，临床上主要用于自身免疫性疾病的治疗。研究发现雷公藤还有抗肿瘤作用。雷公藤对L615，L1210以及P388白血病细胞和来自人体鼻咽癌(KB)细胞均有抑制作用。雷公藤对人白血病细胞系HL-60细胞软琼脂中集落形成也有抑制作用。雷公藤的抗肿瘤成分主要有雷公藤甲素、雷公藤乙素、雷公藤内脂和雷公藤酮等[1]。近来，中国科学院与美国合作，经抗癌机理研究，证实雷公藤红素具有抗癌蛋白酶体抑制作用，能诱发前列腺癌和白血病的癌细胞凋亡[3]。最近研究还发现雷公藤红素对逆转K562 /A02 细胞的耐药性有一定的作用[4]，临床研究发现雷公藤多甙能治疗子宫肌瘤[5]。陆介芳等[6]用雷公藤的提取物雷公藤多甙治疗1例对瘤可宁及COP方案治疗无效的慢性淋巴细胞白血病患者，结果获得显效。我们体外研究显示雷公藤多甙对HL-60细胞有明显诱导凋亡作用，后来国内其他作者研究也得出类似结果,表明雷公藤多甙在体外实验中具有抗白血病活性[7～9]。但是，很多在体外实验中具有抗肿瘤活性的药物在体内抗肿瘤效果并不确定，需要进一步通过动物实验来明确。

重度联合免疫缺陷(SCID)小鼠是美国Bosma证实的属CB-17近交系小鼠第16号常染色体发生隐性突变基因(SCID)的突变型小鼠。纯合的SCID鼠基因导致小鼠几乎完全丧失T和B淋巴细胞的功能，因此，这类小鼠是用于建立移植性人肿瘤模型的理想动物[10]。本研究结果显示，经尾静脉接种HL-60细胞后第22天，20只SCID小鼠的外周血中均出现了与体外培养的HL-60细胞形态类似的白血病细胞。病程后期，模型组小鼠的脾脏中可见大量白血病细胞浸润。与未接种HL-60细胞的小鼠相比，至发病晚期，白血病小鼠均有不同程度的体重下降、精神不振、食欲下降、懒动、行走不稳等一般情况差的表现。这些证据表明，本研究成功建立了重度联合免疫缺陷(SCID)小鼠人HL-60细胞白血病模型，与文献报道的类似[10]。进一步应用该模型进行体内研究结果显示，与模型组比较，雷公藤多甙组小鼠的外周血白细胞总数及白血病细胞数均明显减少、脾脏中白血病细胞浸润程度明显减轻、脾脏细胞凋亡率明显增高、一般情况较好、生存期明显延长。这些证据表明，雷公藤多甙在体内具有抗白血病作用，其机制是通过诱导HL-60细胞凋亡，其潜在抗白血病的临床应用价值值得进一步开发。

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