结直肠锯齿状通路中DNA甲基化的改变

张玉萍综述 王鲁平审校

在世界范围内，结直肠癌(colorectal cancer,CRC)的发病率居恶性肿瘤的第3位，在我国CRC发病率逐年上升，已跃居常见恶性肿瘤的前5位，广东地区和香港地区数字已接近西方国家[1]。据报道2007年10%～15%CRC来自锯齿状病变[2]，而到2011年锯齿状病变的发现率明显提高。美国Minnesota大学Snover教授明确提出35%CRC来自锯齿状病变通路，尤其是来自CpG岛甲基化表型(CIMP)的锯齿状病变，与DNA甲基化密切相关。通过复习文献对锯齿状通路中DNA甲基化的改变做一综述，旨在深刻认识锯齿状通路中的分子机制，为临床提供更准确的诊断及鉴别诊断方法，以达到预防和减少CRC发病率的目的。

1 锯齿状病变

WHO(2010)消化系统肿瘤新分类中把锯齿状病变定义为：一组以上皮锯齿状结构为特征的病变，包括：①增生性息肉(hyperplastic polyp ,HP)，根据黏液类型又分为微小泡型(microvesicula HP,MVHP)、杯状细胞型(goblet cell rich HP,GCHP)和黏液缺乏型(mucin poor HP,MPHP)；②广基锯齿状息肉/腺瘤(sessile serrated adenoma/polyp,SSA/P)，根据细胞异型性分为不伴和伴有细胞异型增生型；③传统锯齿状腺瘤(traditional serrated adenoma,TSA)；④锯齿状腺癌(serrated adenocarcinoma,SAC)。这些病变是1个连续的谱系，有明显的异质性，具有特殊的分子改变，呈现1条与经典“腺瘤-癌”并存的新的致癌途径，即所谓的锯齿状通路(serrated neoplasia pathway)[2]。更有学者认为可能存在2条平行的、几乎很少交叉的锯齿状通路,即:传统锯齿状通路和广基锯齿状通路。

2 DNA甲基化

DNA甲基化是1种表观遗传学修饰，在DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase，DNMT) 的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸(SAM) 为甲基供体,将甲基转移到特定的碱基上的过程。DNA甲基化可以发生在腺嘌呤的N-6位、胞嘧啶的N-4位、鸟嘌呤的N-7位或胞嘧啶的C-5位等。但在哺乳动物,DNA甲基化主要发生在5’-CpG-3’的C上，生成5-甲基胞嘧啶(5mC) 。DNA甲基化修饰异常与肿瘤的发生关系密切，其中包括基因组去甲基化及部分区域高度甲基化2种形式。DNA甲基化可导致抑癌相关基因转录沉默，导致异常基因的积累，使病变迅速进展为癌。有关研究表明DNA甲基化是“锯齿状通路”中关键的启动因素[3]。

2.1 CpG岛甲基化表型(CIMP)

CpG岛是指CpG二核苷酸聚集区域，呈不连续分布，长度>200 kb。在整个基因组中，CpG岛通常位于基因的启动区域，故又称5’-CpG岛。CpG岛甲基化在肿瘤发生、发展过程中扮演着重要角色。基因启动子区CpG岛甲基化常阻止基因的表达，表现这些基因甲基化的癌称为CpG岛甲基化表型阳性(CpG island methlylator phenohype ,CIMP)[4]。

一些学者认为CIMP是锯齿状通路中的特征性改变[5～7]。Park等[7]对22例锯齿状腺瘤(serrated adenoma，SA)和34例管状腺瘤患者的CIMP情况进行研究，结果显示SA中的甲基化位点明显多于管状腺瘤(P=0.00001)；此外，CIMP-H(≥2个甲基化位点)在SA中的发生频率为68%(15/22)，而在管状腺瘤中仅为18%(6/34)。同时大量研究表明CIMP在“锯齿状通路”中期“HPs-SAs”的过程中发挥重要作用。Yang等[8]采用甲基化特异性PCR(methylation specific PCR,MS-PCR)检测79例散发性HP患者和25例SA患者病理组织中的CIMP-H，结果显示CIMP-H在SA中出现的频率(80%)比在HP中高，且差异有统计学意义(P=0.017)；且在异常增生型锯齿状息肉(serrated polyps with abnormal proliferations，SPAPs)、微小囊泡型锯齿状息肉(microvesicular serrated polyps,MVSPs )和杯细胞型锯齿状息肉(goblet cell serrated polyps,GCSPs)中，CIMP-H出现的频率分别为75%、47.4%、15.4%。且在另一文献中，CIMP-H在SPAPs 、MVSPs、GCSPs中的频率分别为92.3%、68.4%和46.2%[9]。根据CIMP-H在GCSPs、MVSPs、SPAPs和SA中(即从低级病变到高级病变)由低到高的频率分布，可以推测其在推动HP向SA进展的过程中以及在锯齿状通路中都起着非常重要的作用，是锯齿状通路的特征性改变。

2.2 CpG岛甲基化在锯齿状病变中的改变

2.2.1 增生性息肉(hyperplastic polyp,HP) HP约占锯齿状病变的75%，一般认为HP不会发生恶变，但新近有足够的证据表明HP具有恶变潜能[10]。Kyoung-Mee 等[11]运用MS-PCR检测45例HPs(包括30例MVHP,11例GCHP和4例MDHP)中MGMT、hMLH1、APC、p16、MINT1、MINT2和MINT31基因启动子区甲基化的情况，表达率分别为42.2%、64.4%、37.8%、60%、68.9%、51.1%和60%，其中p16、 MINT2和MINT31在MVHP中的表达率比在HPs的其他类型中更高(P<0.05)，尤其是在右侧MVHP中。同时检测出CIMP-H在MVHP、GCHP和MDHP中的表达率分别为73.3%、18.2%、75%，尤其是右侧MVHP中CIMP-H表达更显著。此外Kyoung-Mee等[11]还对30例MVHP和56例SSA/P的病变位置、组织学形态、分子学改变进行了大量的对比研究，得出的结论是位于右侧结肠的MVHP可能是SSA/P的1种前驱病变，比其他类型的HP具有相对高的恶变潜能。有研究表明CIMP是推动MVHP向SSA/P发展及向后来的锯齿状腺瘤伴异型增生和癌进展的分子学动力[12]。因此得出结论：相关基因甲基化导致HP的恶变，尤其是右侧MVHP。

2.2.2 广基锯齿状息肉或腺瘤(sessile serrated adenoma/polyp,SSA/P) SSA/P占锯齿状病变的15%～20%，目前被认为是伴有微卫星不稳定性(MSI)特征的散发性CRC的癌前病变[10]。一些重要调控分子(如DNA错配修复基因hMLH1)的启动子甲基化在伴/不伴细胞异型增生的SSA/P中均有发生，当出现hMLH1启动子甲基化时，病变具有了MSI特征，从而导致了细胞学异型性，使SSA/P具有了进展为癌的特性。因此DNA甲基化是SSA/P恶变过程中的重要事件，且SSA/P不论是否伴有细胞异型增生，均应视为癌前病变[13]。Kyoung-Mee 等[11]运用MS-PCR检测的56例SSA/P(包括20例不伴异型增生和36例伴异型增生)中MGMT、hMLH1、APC、p16、MINT1、MINT2和MINT31基因启动子区超甲基化的表达率分别为69.9%、73.2%、37.5%、76.8%、71.4%、58.9 %和71.4%。在这些肿瘤相关基因甲基化的表达率中，除了APC为37.5%，其他的均>50%。同时检测出CIMP-H在不伴和伴有异型增生中的表达率分别为75.0%和77.8%。以上结果表明在SSA/P中表现为广泛的DNA甲基化，DNA甲基化在SSA/P恶变过程中起关键作用。

2.2.3 传统锯齿状腺瘤(traditional serrated adenoma,TSA) TSA占锯齿状病变的1%左右，它在锯齿状通路中的作用存在争议，但研究表明TSA具有恶变为CRC的潜能[14]。TSA常与MSI-L特征(如MGMT启动子甲基化)的癌有关,MGMT基因甲基化后，引起一些基因沉默，发展为MSI-L癌。在表观遗传学方面，主要表现为低水平DNA甲基化[15]。Kyoung-Mee 等[16]收集了112例TSAs，通过研究发现MGMT和hMLH1甲基化在TSAs中的表达率为63%和56%。而且发现在锯齿状通路中，TSA进展主要伴随着hMLH1甲基化和BRAF基因突变，而MGMT甲基化和KRAS基因突变是此通路中的1个晚期事件，这些肿瘤相关基因异常甲基化和突变证明TSA具有一定的恶变潜能。但是DNA甲基化在TSA恶变中的作用尚不十分明确，仍需更深入的研究。

2.2.4 锯齿状腺癌(serrated adenocarcinoma， SAC) SAC是由具有恶变潜能的TSA、SSA等锯齿状病变沿锯齿状通路发展而来的，是锯齿状通路的终点。SAC的发生与CpG岛甲基化密切相关：①传统锯齿状通路所引起的SAC，大多由KRAS突变引发。KRAS突变导致早期的锯齿状损害TSA和GCHP[17]，而且会引起低水平CpG岛甲基化现象(CIMP-L)。CIMP使MGMT基因启动子出现甲基化而失活，导致TSA病变的异型性程度进一步增加，最终发展成为SAC。②广基锯齿状通路所引起的SAC，主要是由BRAF突变所引起的。BRAF突变导致了早期锯齿状损害MVHP和SSA，也促进了基因启动子区域CpG岛甲基化[17]。据研究MVHP和SSA均表达较高的CIMP-H[11]，而CIMP-H会导致相关病理性的基因沉默，如hMLH1。在广基锯齿状通路中，hMLH1甲基化是1个晚期事件，导致SSA异型程度进一步增加，最终发展成为SAC[17]。据研究发现hMLH1甲基化只出现在广基锯齿状通路中而不出现在传统锯齿状通路中， 而MGMT甲基化在2条通路中均可见[18]。CIMP-H是广基锯齿状通路的重要特征，而CIMP-L则常出现在传统锯齿状通路中[19]，由此可见CIMP是TSA、SSA发展成SAC的关键，锯齿状通路中起了重要的作用。

3 锯齿状病变分子遗传学与DNA甲基化的关系

3.1 微卫星不稳定性与DNA甲基化

微卫星不稳定性(microsatellite instability,MSI)是复制错误(replication error,RER)引起的微卫星DNA序列改变，使基因失去正常生理调控功能，引起细胞增生及分化异常，参与肿瘤发生。目前研究表明，与传统腺瘤-癌途径相比，MSI常出现在锯齿状通路中，MSI的发生主要与hMLH1和MGMT启动子区甲基化有关。Hawkins等[20]选取了29例MSI结直肠癌和29例微卫星稳定((microsatellite stability ,MSS)结直肠癌患者进行对比研究，结果显示MSI结直肠癌含较多的锯齿状息肉，而且hMLH1基因的甲基化失活在MSI和MSS结直肠癌中的比率分别为76.9%(10/13)和0，因此可推测hMLH1基因启动子甲基化失活可能是锯齿状息肉发展为MSI结直肠癌的危险因素。Jass等[21]通过研究11例结直肠癌和13例不典型增生样病变发现，在13例不典型增生样病变中有7例呈现MSI，其中4例是MSI-H，hMLH1都没有表达，3例是MSH-L，hMLH1都有表达；11例结直肠癌中8例呈现MSI，其中6例是MSI-H，hMLH1都没有表达，2例MSH-L，hMLH1都有表达。hMLH1的表达缺失和hMLH1基因启动子区甲基化有关，因此上述结果表明hMLH1甲基化和MSI-H密切相关。同时Whitehall等[22]选取31例锯齿状息肉(包括增生性息肉、HP/AD和锯齿状腺瘤)，其中29%(9/31)出现MGMT的表达缺失，这些表达缺失由MGMT的启动子甲基化引起。MGMT表达缺失的9例中，7例呈现MSI，其中5例呈现MSI-L，2例呈现MSI-H，因此可推断MGMT甲基化与MSI-L相关。以上研究表明在锯齿状通路中MSI的发生与DNA甲基化有关，尤其是hMLH1和MGMT启动子区甲基化。

3.2 BRAF基因突变与DNA甲基化的关系

BRAF错义突变发生于近8%人类肿瘤中，约15%结直肠癌患者有BRAF基因突变[23]。研究表明BRAF突变是锯齿状通路中1个特殊的分子标志，起源于锯齿状异常隐窝灶或MVHP中，随着CIMP-H的出现，形态学逐渐表现异型增生，最终进展为癌。一些学者对“锯齿状通路”中的增生性息肉、锯齿状腺瘤等进行研究,发现在BRAF突变的组织中几乎都存在CIMP阳性表达[24]。还有研究发现CIMP-H是伴BRAF突变的锯齿状病变的重要特征[19]。Kambara等[3]通过对57例锯齿状息肉和145例CRC的研究发现BRAF基因突变与DNA甲基化存在着一定的关系，根据甲基化位点的多少，将CpG岛甲基化表型分为 CIMP-H、CIMP-L和非CIMP 3组，在锯齿状息肉中BRAF基因在这3组的突变率分别为72%、30%、13%(P=0.002)，CRC在3组的突变率分别为77%、18%、0(P<0.0001)。因此在锯齿状通路中BRAF基因突变与CIMP密切相关，尤其是CIMP-H。

3.3 KRAS基因与DNA甲基化的关系

KRAS是与BRAF在同一信号途径中相继发挥作用的另一个信号转导分子，两者相互独立,研究表明KRAS发生在GCHP和TAS中。GCHP通常较小，缺乏可确认的后续病变，表明GCHP不大可能是锯齿状通路的前驱病变[25]。但是有研究表明在GCHP中KRAS突变率可达50%[26]，且在传统锯齿状通路中GCHP可能是TAS的前驱病变。同时Kyoung-Mee等[11]发现CIMP在GCHP中表达水平可达18.2%[11]，所以可推测由于KRAS突变和CIMP的发生，GCHP具有一定的恶变潜能。TSA中KRAS突变率报道不一，可达36%[27]。KRAS突变的TSA可进展为混合性管状绒毛状腺瘤表型，后期可获得高度异型增生并进展为癌,该过程的主要分子学基础是CIMP-L，而有关研究也表明KRAS基因突变常常伴有CIMP-L[28]。在锯齿状癌变途径中关于KRAS基因突变与DNA甲基化的关系尚不十分明确，有待于进一步的研究。

3.4 RUNX3基因与DNA甲基化

RUNX3[29]是1个新的抑癌基因，是TGF-β转导通路对上皮细胞生长起调控作用的1个重要环节。Ku等[30]采用逆转录聚合酶链反应、聚合酶链反应-单链构象多态性分析和甲基化特异性聚合酶链反应技术检测了32种结直肠癌细胞系和87例癌组织中RUNX3基因的突变杂合性缺失和启动子甲基化状态，发现有16种癌细胞系存在RUNX3基因表达缺失或下调，其中75%(12/16)存在启动子的高甲基化。在87例癌组织中有16例(18.4%)检测到RUNX3基因的甲基化，而在相应的正常组织中均未发现RUNX3基因的甲基化。Subramaniam等[31]通过免疫组化方法比较发现HP和TSA中RUNX3的阳性表达率较正常结肠黏膜组织和管状腺瘤(Tubular adenoma,TA)中有所下降；并应用甲基化特异性PCR来检测RUNX3启动子的高度甲基化，以12例正常肠组织黏膜作对照，结果显示：SA包括HP和TSA，较TA中RUNX3的甲基化表达率明显增高。由此我们得出结论，锯齿状病变中RUNX3基因的失活与甲基化密切相关，而且可推测由RUNX3的失活引起的启动子甲基化是SA恶变过程中的1个早期事件。

总之，越来越多的研究证明锯齿状病变的恶变潜能高于传统的息肉/腺瘤[32]，主要的恶变途径是锯齿状通路，但是目前对该通路的研究尚不完善，尤其是在表观遗传学方面。正确的认识锯齿状通路中DNA甲基化的改变，将为锯齿状病变提供可靠的鉴别诊断方法，对于早期诊断锯齿状癌前期病变和理解癌变机制也具有重要的科学意义，而且可以获得CRC早期预防、诊断及高发风险的标记物。虽然研究已表明CRC有若干高度甲基化的基因，而且不同类型锯齿状病变也伴有不同基因的异常甲基化，但是它们之间关系尚不十分清楚，因此锯齿状通路中DNA甲基化的改变有待于进一步研究。

[1]赖少清， 鞠凤环， 王贵齐，等.2004～2008年704例大肠癌临床流行特征〔J〕.中国肿瘤,2010,19(2) :111.

[2]Makinen MJ.Colorectal serrated adenocarcinoma〔J〕.Histopathology,2007,50(1):131.

[3]Kambara T,Simms LA,Whitehall VL,et al.BRAF mutation is associated with DNA methylation in serrated polyps and cancers of the colorectum〔J〕.Gut,2004,53(8):1137.

[4]Yamauchi T,Watanabe M,Hasegawa H,et al.Serrated adenoma developing into advanced colon cancer in 2 years〔J〕.J Gastroenterol,2002,37(6):467.

[5]Tuppurainen K,Makinen JM,Junttila O,et al.Morphology and microsatellite instability in sporadic serrated and non-serrated colorectal cancer〔J〕.J Pathol,2005,207(3):285.

[6]Chan AO,Broaddus RR,Houlihan PS,et al.CpG island mehtylation in aberrant crypt foci of the colorectum 〔J〕.Am J Pathol,2002,160(18):1823.

[7]Park SJ,Rashid A,Lee JH ,et al.Frequent CpG island methylation in serrated adenomas of thr colorectum 〔J〕.Am J Pathol,2003,162(8):815.

[8]Yang S,Farraye FA,Mack C,et al.BRAF and KRAS mutations in hyperplastic polyps and serrated adenomas of the colorectum:relationship to histology and CpG island methylation status〔J〕.Am J Surg Pathol,2004,28(11):1452.

[9]O’Brien MJ,Yang S,Clebanoff JL,et al.Hyperplastic(serrated) polyps of the colorectum:relationship of CpG island methylator phenotype and K-ras mutation to location and hiatologic subtype〔J〕.Am J Surg Pathol,2004,28(4):423.

[10]Jass JR.Serrated route to colorectal cancer:back street or super highway 〔J〕.J Pathol,2001,193(3):283.

[11]Kyoung-Mee K，Eui JL,Sangyun H,et al.Molecular Features of Colorectal Hyperplastic Polyps and Sessile Serrated Adenoma/Polyps From Korea〔J〕.Am J Surg Pathol,2011,35(9):1274.

[12]Weisenberger DJ，Siegmund KD，Campan M，et al.CpG island methylator phenotype underlies sporadic microsatellite instability and is tightly associated with BRAF mutation in colorectal cancer〔J〕.Nat Genet，2006，38(7)：787.

[13]Snover DC,Ahnen DJ,But RW,et al.Serrated polyps of the colon and rectum and serrated polyposis〔A〕.WHO Pathology and genetics tumors and digestive system 〔M〕.Lyon:IARC Press,2010:160.

[14]Torlakovic E,Skovlund E,Snover DC,et al.Morphologic reappraisal of serrated colorectal polyps〔J〕.Am J Surg Pathol,2003,27(1):65.

[15]Ogino S,Kawasaki T,Kirkner GJ,et al.Molecular correlates with MGMT promoter methylation and silencing support CpG island methylator phenotype-low (CIMP-low) in colorectal cancer〔J〕.Cut,2007,56(11):1564.

[16]Kyoung-MeeK，Eui JL,Young-Ho K,et al.KRAS mutations in traditional serrated adenomas from Korea herald an aggressive phenotype〔J〕.Am J Surg Pathol,2010,34(5):667.

[17]Snover DC.Update on the serrated pathway to colorectal carcinoma〔J〕.Hum Pathol,2011,42(1):1.

[18]Sheridan TB,Fenton H,Lewin MR,et al.Sessile serratedadenomas with low-and high-grade dysplasia and early carcinomas〔J〕.Am J Clin Pathol,2001,126(4):564.

[19]催 云，方静云.大肠癌发生学的新观点-"锯齿状突进"〔J〕.中华医学杂志，2009,89(4):283.

[20]Hawkins NJ,Ward RL.Sporadic colorectal cancers with microsatellite instability and their possible origin in hyperplastic polyps and serrated adenomas〔J〕.Clin Cancer Res,2004,10(9):3082.

[21]Jass JR，Whitehau VL， Young J，et al.Emerging concepts in colorectal neoplasia〔J〕.Gastroenterology，2002，123(3)：862.

[22]Whitehall VL，Walsh MD，Young J，et al.Methylation of O-6一methylguanine DNA methyltransferase characterizes a subset of colorectal cancer with low level DNA microsatellite instability〔J〕.Cancer Res，200l，61(3)：827.

[23]Davies H ,Bignell G R,Cox C,et al.Mutations of the BRAF gene in human cancer 〔J〕.Nature,2002,417(6892):949.

[24]Jass JR.Serrated adenoma of the colorectum and the DNA-methylator phenotype〔J〕.Nat Clin Pract Oncol，2005，2(3)：398.

[25]O’Brian MJ，Yang S,Mack C，et al.Comparison of microsatellite instability,CpG island methylation phenotype，BRAF and KRAS statusin serrated polyps and traditional adenomas indicates separate pathways to distinct colorectal carcinoma end points〔J〕.Am J Surg Pathol,2006 ,30(12)：1491.

[26]Spring KJ,Zhao ZZ,Karamatic R,et al.High prevalence of sessile serrated adenomas with BRAF mutationa:a prospective study of patients endergoing colonscopy 〔J〕.Gastroenterology,2006,131(5):1400.

[27]Chan TL,Zhao W,Leung SY,et al.BRAF and KRAS mutations in colorectal hyperplastic polyps and serrated adenomas〔J〕.Cancer Res,2003,63(13):4878.

[28] Jass JR，Iino H，Ruszkiewicz A，et al.Neoplastic progression occurs through mutator pathways in hyperplastic polyposis of the colorectum〔J〕.Gut,2000,47(1)：43.

[29]代小娟，韩 英，王鲁平.结直肠锯齿状腺瘤恶变潜能的研究进展〔J〕.实用癌症杂志，2009，24(5)：548.

[30]Ku JL，Kang SR，Shjn YK，et al.Promoter hypermethylation down-regulates RUNX3 gene expression in colorectal cancer cell lines〔J〕.Oncogene,2004,23(40):6763.

[31]Subramaniam MM，Chan JY，Soonq R.RUNX3 inactivation in colorectal polyps arising through different pathways of colonic carcinogenesis〔J〕.Am J Gastroenterol，2009，104(2)：426.

[32]代小娟，韩 英，王鲁平，等.自身配对的锯齿状腺瘤与传统腺瘤临床病理特征的比较〔J〕.实用癌症杂志，2010，25(3)：277.