MKK4在肿瘤发生发展中的作用＊

罗洪亮 综述，朱培谦审校

（南昌大学第二附属医院胃肠外科，南昌330006）

丝裂原活化蛋白激酶（mitogen－activated protein kinases，MAPK）是真核生物信号传递网络中的重要途径之一，在调控细胞凋亡、生长以及一些重要基因的表达中发挥重要作用[1]。现已经确认在哺乳动物中存在4条不同的MAPK通路：extra－cellular signal－regulated kinase（ERK）、ERK5、c－Jun N－terminal kinase（JNK）、p38，其中JNK和P38被称为应激活化MAPK通路[2]。一系列的MKKs可以激活JNK和P38，如MKK3、MKK6可以激活P38，MKK7可以激活JNK，只有MKK4能同时激活JNK和P38。

研究表明JNK和P38具有肿瘤抑制作用[3]，大约5%的各种肿瘤中发现了丧失功能的MKK4基因突变[4]。但另外一些学者的研究指出MKK4和JNK参与肿瘤的形成。这说明这条通路在肿瘤的发生、发展扮演着复杂的角色。因此，笔者描述MKK4的生物学性状并讨论它是怎样调控肿瘤发生、发展的。

1 MKK4的生物学性状

1.1 MKK4的结构 人的MKK4基因位于第17染色体，它编码一条含399个氨基酸的蛋白[5]。所有哺乳动物的MKK家族约有40%的同源性，MKK4与MKK7最为相似，大约有50%相同[6]。MKK4蛋白结构可分为3个部分：位于N端的D域序列在信号级联反应中与JNK和P38连接；中间为激酶区（KD），包括11个亚基，7、8亚基间的S－I－A－K－T序列的丝氨酸和苏氨酸残基磷酸化后激活MKK4；位于C端的DVD域序列能与上游的各种MKKKs级联（图1）。MKK4与上下游之间的相互作用被看作是这条MAPK信号传导通路的关键所在[7]。

1.2 MKK4的组织分布 MKK4 m RNA广泛的表达于成年小鼠和人体的组织中，并且在脑的表达最高，特别是在大脑皮质、丘脑、海马体和小脑。在小鼠早期胚胎形成过程中（胚胎形成的前10d）MKK4仅局限地表达于中枢神经系统，从12 d开始，MKK4开始在肝脏中表达，并与肝的分化和生长发育相一致。亚细胞定位研究显示MKK4蛋白主要存在于细胞质中，一些细胞核中也有少量表达[8]。MKK4在免疫系统中也起到一定的作用，但确切的作用尚不完全清楚，一组研究表明MKK4缺失会严重影响B细胞和T细胞的生长发育，但另一组研究却没有发现明显的证据表明MKK4对B、T细胞的生长发育是必需的。MKK4信号传导通路同样作用于由于心肌负荷量增大引起的心肌代偿性肥大[9]。

图1 MKK4蛋白结构

2 MKK4在MAPK的机制

2.1 上游基序激活MKK4 MKKKs通过磷酸化位于MKK4蛋白KD区域中Ser－Ile－Ala－Lys－Thr序列内的丝氨酸／苏氨酸残基而激活MKK4。这些MKKKs包括促分裂素细胞外调节激酶激酶（MEKK）、混合酶谱激酶（MLK）、细胞凋亡信号调节激酶1（ASK1）、转化生长因子－β（TGF－β）－活化蛋白激酶－1（TAK1）和Tp L2[10]。不同的MKKKs激活不同的MKKS，例如，MEKK1和TAK1都能磷酸化MKK4和MKK7，而MEKK4只能磷酸化MKK4，这是因为MEKK1能连接到MKK4和MKK7都有的C－末端DVD位点上，而MEKK4只能特异性地连接到MKK4。一个关于MEKK1，MKK4，JNK的连续二聚交互体信号传导通路模型已被提出，即MEKK1结合MKK4并使之磷酸化，然后再脱离MKK4；活化的MKK4连接到JNK并使之磷酸化。除了MAPK信号传导通路中各成分之间的直接相互作用之外，其相关的支架蛋白也能通过改变这条通路的成分和促进他们的激活来调节这条通路。

2.2 MKK4激活JNK和P38 MKK4是MKKS家族中惟一能同时磷酸化和激活JNK和P38通路的激酶，并且MKK4能激活所有的JNK亚型（JNK1、JNK2、JNK3）和部分P38亚型（p38a、p38b）。

图2 MKK4促细胞凋亡的机制

2.2.1 MKK4－JNK调节细胞凋亡 对于JNK通路，一些体外的研究提示MKK4能磷酸化JNK酪氨酸残基，而MKK7能磷酸化苏氨酸残基，这些结果就引出了一个关于MKK4，MKK7协同激活JNK通路的假说。一些利用特定缺失MKK4和MKK7的小鼠胚胎干细胞和胚胎成纤维细胞在小鼠体内的研究也支持这个假说，这些研究同时显示不同的刺激可以有差别的利用的MKK4和MKK7：在MKK7缺失的胚胎成纤维细胞中，JNK对细胞炎性因子、肿瘤坏死因子－α（TNF－α）和白细胞介素－1等刺激所引起的激活效应几乎完全消失，而在MKK4缺失的细胞中，其激活效应降低50%。这就说明在这些因素引起的JNK激活效应中MKK7是必须的，而MKK4则是选择性的；以此相对的，在应对外界环境的刺激（紫外线、热休克、渗透压变化）引起的JNK激活效应，MKK4、MKK7表现出相似的作用[11]。

JNK通路一直被认为与调节细胞凋亡有关，但它的机制还不是完全清楚。目前提出了两个假说来解释JNK如何调节细胞凋亡。第一个假说是，JNK诱导细胞凋亡，它通过在线粒体水平激活内源性细胞凋亡途径的促凋亡蛋白并且诱导细胞色素C释放，然后启动caspase级联反应引起细胞凋亡。JNK能直接磷酸化并激活含BH3结构域的促凋亡蛋白Bim、Bmf，使它们从细胞骨架上脱落下来并从新分配到线粒体膜上，引起线粒体膜的通透性改变并释放细胞色素C。JNK调节紫外线诱导成纤维细胞凋亡的实验支持这个假说，缺失JNK的成纤维细胞能完全抵抗紫外线诱导的细胞凋亡，并且明显减少细胞色素C的释放，而该细胞的由Fas／CD95介导的外源性细胞凋亡途径不受影响[12]。另外一种假说是，JNK对外源性细胞凋亡途径起调节作用，如对Fas－FADD－caspase和TNFRITRADD－FADD－caspase通路的调节，但只起促进作用而不是启动作用。JNK的持续活化是TNFa介导的细胞凋亡所必需的，JNK的持续活化对一些抗细胞凋亡分子如c FLIP（细胞型FADD样白细胞介素－1转换酶抑制蛋白）的失活是必要的。在这些调节过程中，JNK是通过影响细胞对活化AP－1家族（cJun、cFos等）产生的反应来调节细胞周期调节蛋白的表达。这些通路中的JNK的浓度和持久度决定了细胞在接受外源性调往信号的刺激时是否会凋亡[13]（图2）。

2.2.2 MKK4－P38与细胞周期 越来越多的研究表明，MKK4能激活P38进而参与细胞周期的调节，在用MKK4缺陷胚胎成纤维细胞研究P38是否有激活障碍的实验过程中，当受到的刺激是TNF和白细胞介素－1的时候，P38的活化明显受限。在缺乏特异性激活P38的MKK3，MKK6的胚胎成纤维细胞中，MKK4接受紫外线的刺激能激活P38的实验也证明MKK4能激活P38。在这个试验中还观察到可以通过改变MKK4的水平来调节P38活化反应的强弱。与MKK4激活JNK过程中先是酪氨酸残基磷酸化不同的是，MKK4激活P38过程中是酪氨酸，苏氨酸残基同时磷酸化[14]。MKK4激活P38后通过两条途径来遏止细胞周期进程，一条是直接磷酸化并抑制cdc25B分子，使CyclinB／cdc2复合物不能被激活，阻止进入有丝分裂。这种机制在肿瘤细胞周期阻滞中非常重要：紫外线和烷化剂类化疗药物能介导这种依赖P38的G1／S或G2／M细胞周期停滞通路[15]。另外一条和JNK一样通过调控细胞周期基因的表达使细胞周期停滞或细胞凋亡。JNK和P38都能通过磷酸化活化蛋白－1家族（AP－1）转录因子的c－Jun，ATF－2，MEF2C亚基来调节AP－1的活性，而一些细胞调节蛋白包括Cyclin D1、p53、p21Cip1、p16INK4A、p19Arf都被认为是被AP－1调节的靶基因，这些基因的编码产物都参与调节细胞凋亡和DNA损伤反应[16]。

3 MKK4与肿瘤

过去的研究表明MKK4对肿瘤的发生、发展的起调节作用，MKK4是肿瘤抑制基因或是肿瘤转移抑制基因，但也有一部分研究提示它是亲癌基因。这说明MKK4和它下游的JNK、P38在肿瘤的进展过程中有着更为复杂的作用。

3.1 MKK4基因的突变对肿瘤的抑制作用 抑癌基因的缺失或是失活会促进肿瘤的形成和发展，MKK4作为抑癌基因的最早在1997年，有研究发现2株胰腺癌和肺癌细胞株均缺失能编码MKK4的基因位点。并且他们对88株来自结肠癌，乳腺癌、胰腺癌、睾丸癌的细胞株的研究发现MKK4基因发生了2种无意义的突变和3种错义的突变，而这些突变导致一些MKK4蛋白的关键亚基无法合成或者具有重要功能的氨基酸被替换致使无法磷酸化JNK。另一个支持MKK4具有肿瘤抑制作用的是MKK4基因显性无意义的突变能促使胚胎干细胞变异并提高致瘤性。近年的研究发现原发性的胰腺癌、胆管癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌MKK4基因的错义或无义的突变率为约。同样的突变在肺癌内也发现。另外在对胰腺癌的研究中还发现MKK4（＋）的胰腺癌患者的死亡率只有MKK4（－）胰腺癌患者的一半，MKK4与存活时间相关[17]。

3.2 MKK4的肿瘤转移抑制作用 MKK4同样与肿瘤的转移有关。研究发现在正常前列腺上皮组织中有高水平的MKK4蛋白表达，前列腺肿瘤组织中MKK4表达显著降低，并且发现MKK4的低水平表达与转移能力有关。有研究将具有高度转移性的小鼠前列腺癌细胞株AT6.1（缺乏MKK4表达）和转染了MKK4的该种细胞株（AT6.1－MKK4）注入到重度联合免疫缺陷的小鼠体内，观察他们的肺转移情况。结果显示与AT6.1（缺乏MKK4表达）的小鼠相比，AT6.1－MKK4的小鼠肺肉眼转移灶明显减少，并且存活时间显著延长，而原发肿瘤灶无明显差异。说明了MKK4具有肿瘤转移抑制作用。同时，在AT6.1－MKK4的小鼠肺内发现了微转移灶提示肿瘤细胞已从原发灶逃离但在肺里的生长得到抑制。此外，JNK另外一个激活体MMK7，也能通过抑制AT6.1细胞在肺的克隆来抑制转移；而P38的激活者MKK6却不能，说明MKK4是通过介导JNP通路来抑制前列腺癌的转移。最近Victoria等[18]提出肿瘤细胞内MKK4蛋白表达的调节是在MKK4 m RNA翻译MKK4蛋白阶段的假说，他们用PCR和免疫印迹法检测了人类PC3、LNCaP、C4－2、DuPro和DU145前列腺癌细胞株，SKOV3ip.1、SKOV3、CaOV3、Hey A8卵巢癌细胞株，Hela宫颈癌细胞株的MKK4蛋白表达量和MKK4 mRNA量并以小鼠脑细胞作为阳性对照，不表达MKK4的ASPC－1胰腺癌细胞株作为阴性对照。结果发现在这些不同细胞的细胞核中MKK4蛋白和MKK4 mRNA都没有明显的差异，而在胞浆中，MKK4高表达细胞的MKK4蛋白量和MKK4 mRNA量都明显高于MKK4低表达细胞，提示MKK4表达的调控在翻译阶段。

Yamada等[19]的研究发现与正常的卵巢上皮细胞相比，卵巢癌细胞的MKK4蛋白表达同样降低了，并且MKK4蛋白表达水平高的卵巢癌转移能力较MKK4缺乏的明显降低并且存活期延长了70%。将人类卵巢癌细胞株SKOV3ip.1（很少表达MKK4蛋白）和转染了MKK4的SKOV3ip.1细胞株注射到免疫缺陷的小鼠腹腔中，30d后发现转染了MKK4的SKOV3ip.1细胞株引起的网膜转移灶较无MKK4的降低了88%[20]。

还有研究表明MKK4对肿瘤转移抑制的调控可能是通过降低肿瘤细胞的黏附作用、促进细胞凋亡和抑制细胞的增殖实现的。实时定量PCR显示注入癌细胞株后第3天在网膜上出现的两组癌细胞并无明显差别；用镜下观察和免疫组化法检测的两组微小转移灶也无明显差别。用Brd U（S期标记物）和p H3（M期标记物）同时标记到两组微转移灶的癌细胞内，发现标记了Brd U和p H3的SKOV3ip.1－MKK4癌细胞较未转染MKK4的明显减少，提示SKOV3ip.1－MKK4细胞很少通过细胞周期中的S、M期而处于休眠期或是凋亡状态。而在SKOV3ip.1－MKK4细胞中细胞周期抑制蛋白p21明显增高，约是对照组的10倍[21]。在另外一个卵巢癌动物实验模型中，发现p38的另一个激活者MKK6同样能抑制肿瘤的转移，而JNK的另一激活者MKK7却不能，说明MKK4是通过介导p38通路来抑制卵巢癌的转移。这些研究说明MKK4在不同的器官和不同的环境下通过介导不同的MAPK通路来发挥肿瘤转移抑制作用。

3.3 MKK4的亲癌性 并不是所有有关MKK4的研究都支持MKK4基因为抑癌基因，同样，也有一部分实验说明MKK4具有促癌作用。在一些缺乏内源性MKK4的乳腺癌和胰腺癌细胞株经异位表达的MKK4刺激后肿瘤细胞的增殖能力和侵袭力都明显增强。相反的，用siRNA技术敲除MMK4阳性的乳腺癌细胞株的MKK4基因后发现癌细胞的非停泊性生长减弱，细胞凋亡易感性和抑制肿瘤生长能力增强。另外，而人支气管上皮细胞株MKK4基因有意义的突变能增加细胞的增殖能力和侵袭力。这些研究都提示MKK4的亲癌性。

此外，Cunningham等[22]用特异性靶向断裂胰腺癌细胞株PL5的MKK4基因的实验同样论证了MKK4的促癌作用。静脉注射原代PL5细胞或是MKK4（＋）的小鼠，有大部分的小鼠发生肺转移；而注射MKK4的小鼠只有少数发生肺转移。当皮下注射MKK4（－）PL5时，小鼠肿瘤的体积翻倍时间较注射原代PL5或MKK4（＋）的明显延长，都提示MKK4促进肿瘤生长。在促癌作用机制中MKK4主要通过介导JNK通路来促进肿瘤的生长。Huang等[23]用免疫组化和RT－PCR技术对多例喉鳞癌的研究发现喉鳞癌组织MKK4的阳性表达率远高于癌旁正常组织MKK4的表达，并且MKK4的阳性表达与淋巴结转移正相关。Finegan和Tournier[24]建立了一种新的小鼠模型，即用致癌物诱导特异性缺失MKK4的表皮生成乳头状瘤。结果发现特异性缺失MKK4表皮的小鼠能抵抗肿瘤发生。其机制是MKK4通过激活JNK信号通路来增加表皮生长因子的表达来促进细胞增殖和肿瘤形成。总之，这些研究表明MKK4对肿瘤发生、发展的调节方式取决于不同的条件，并且能根据不同的组织类型、不同环境以及与其他的细胞内信号通路的相互作用选择不同的途径。

4 展 望

MKK4作为MAPK信号传导通路的构成部分，在调节不同肿瘤的发生发展所到作用差异性提示它在调节过程中可能涉及到多种因子的共同作用，存在着极为复杂的机制，人们的认识并不是十分清楚。因此，还需通过建立合适的实验模型，加强对MKK4的研究，进一步了解它在不同肿瘤的发病中机制，明确它与不同肿瘤的发生发展及预后的关系，为肿瘤的早期诊断和个体化靶向治疗奠定基础。

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