灵芝孢子粉对杏仁核点燃模型大鼠神经元凋亡的影响

张继国，王 艺，张 静，邱彦龙

(泰山医学院，山东 泰安 271016)

癫痫是神经系统的常见疾病，是反复发作的脑神经元的高度同步放电所导致的暂时性脑功能失调，发作时具有多种行为或运动方面的表现。癫痫发作后脑损伤的机制尚未阐明，有观点认为细胞凋亡是导致脑损伤的重要环节之一［1-2］。我们既往的研究证实灵芝孢子粉能够明显降低杏仁核点燃大鼠海马TNF-α mRNA和IL-6 mRNA的表达，对癫痫发作导致的大脑神经元损伤有明显的保护和治疗作用［3］。本研究以杏仁核点燃模型大鼠为研究对象，观察灵芝孢子粉对预处理后大鼠神经元凋亡的影响，为防治癫痫导致的脑组织损伤提供依据。

1 材料

灵芝孢子粉(灵芝宝尔)，购自山东宝来利来生物工程股份有限公司。

原位末端标记检测(TUNEL)试剂盒德国宝灵曼公司。

SEY-3201电子刺激器;脑立体定位仪(江湾I型C);SMUP-PC四道生物信号微机处理系统。

雄性大鼠Wistar 24只，体质量180～300 g，山东大学实验动物中心提供，合格证号:鲁动质字200001001。

2 方法

2.1 动物模型的建立

雄性Wistar大鼠24只，按文献［3］方法建立杏仁核点燃模型。

2.2 分组及治疗

模型大鼠随机分成灵芝孢子粉组、阴性对照组和阳性对照组3组，每组8只。灵芝孢子粉组给予30 mg/mL灵芝孢子粉(用生理盐水配制)10.0 mL/kg，阴性对照组给予生理盐水，阳性对照组给予苯巴比妥(35 mg/kg)，均灌胃给药，1次/d，给药2周。

2.3 检测方法

处死大鼠，1%多聚甲醛心脏灌注取脑海马组织、石蜡包埋连续冠状切片，采用原位杂交末端标记(TUNEL)试剂盒，按说明书进行操作。切片常规脱蜡后乙醇逐级脱水，蛋白酶K消化(37℃，30 min)，磷酸盐缓冲液清洗后滴加TUNEL反应液(TDT缓冲液 8 μL，2 mmol/L Bio-dUTP 溶液 3 μL，TDT 酶0.4 μL，三蒸水 28.6 μL)，37 ℃，2 h;滴加复合液，37℃，1 h;DAB显色5～20 min(镜下监测)，显色满意后终止反应;苏木素复染，常规脱水、透明，中性树脂封片、镜下观察。每只大鼠取2张切片，100倍光镜下对TUNEL阳性细胞进行计数。

2.4 统计处理

3 结果

TUNEL阳性细胞核染色呈棕黄色，核固缩呈不规则形或圆形，高倍镜下可见染色质深染聚集成块或碎裂、核边集。阳性对照组和灵芝孢子粉组大鼠凋亡细胞与阴性对照组比较明显减少(P＜0.05)，阳性对照组和灵芝孢子粉组之间无明显差异(P＞0.05)。见表1。

表1 TUNEL法检测大鼠脑组织细胞凋亡结果(n=8，±s)

表1 TUNEL法检测大鼠脑组织细胞凋亡结果(n=8，±s)

与阴性对照组比较:1P＜0.05

组 别 凋亡细胞数/(个/mm2)阴性对照组42.08±4.29阳性对照组 21.25±4.031灵芝孢子粉组 23.17±3.731

4 讨论

药物治疗是目前治疗癫痫的主要方式，西医抗癫痫药物虽可使大多数患者的病情得以控制，但其毒副作用较大。中医中药以其疗效稳定，无明显毒副作用等优势，越来越引起国内研究者的重视。

灵芝是担子菌纲多孔菌科(Polyproraceae)灵芝属(Ganoderma)真菌赤芝(G.lucidum Karst)和紫芝(G.japonicum Lloyd)的总称，一种珍贵的药用真菌，具有扶正固本等功效。灵芝发育后期弹射释放出来灵芝孢子粉(Ganoderma Lucidum Spore)含有蛋白质和氨基酸类、糖肽类、维生素类、甾醇类、三萜类、生物碱类、脂肪酸类、内酯和无机离子等良好的生物活性物质［4-5］，在临床主要用于抗肿瘤、抗心血管系统疾病、解毒保肝和调节神经系统［6］。近年来，进行了大量试验充分显示了灵芝孢子粉对癫痫治疗的优势并对其可能机理进行了研究［7-8］。

癫痫的发病机制目前还不完全清楚，涉及很多因素包括多种基因的表达异常、脑内神经递质释放异常、细胞凋亡等。细胞凋亡可能是癫痫患者脑神经元死亡的一种重要方式，对癫痫的发病起着重要的作用。本研究结果显示，癫痫发作可导致海马神经元的凋亡增多，而灵芝孢子粉可明显减少和下调杏仁核点燃大鼠脑组织细胞凋亡，对癫痫发作导致的大脑神经元凋亡有明显的保护作用。

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［3］ 张继国，王 艺，张 静.灵芝孢子粉对杏仁核点燃模型大鼠神经元的功能性保护作用及机制［J］.中国生化药物杂志，2012，33(2):145-147.

［4］ Bengzon J，Mohapel P，Ekdahl C T，et al.Neuronal apoptosis after brief and prolonged seizures［J］.Prog Brain Res，2002，135:111-119.

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