板栗中蛋白质的分离鉴定及活性研究

李 艳，张太平，张鹤云

(南京大学 生命科学学院 医药生物技术国家重点实验室，江苏 南京 210093)

板栗(Castanea mollissima Blume)又名大栗(《浙江天目山药用植物志》)栗果(《滇南本草》)、栗实(《新修本草》)等［1］。具有一定的保健功能，本草纲目称栗果有“补肾益气，治腰，脚无力;内寒腹泄;活血化淤”等功效［2］，中医上又把栗子称为“肾之果”。迄今为止国内外对板栗的研究多在化学成分的鉴定上，对其药理作用的研究少之又少，尤其是蛋白质的研究还未见报道。本实验对板栗中蛋白质的活性进行了研究，为板栗"补肾"提供科学数据，为板栗的深度开发利用提供参考。

1 材料

板栗，由河北省兴隆县提供。

DMEM(批号:NVH0303)，赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司;胰蛋白酶(批号:24301316)，AMRESCO;四甲基偶氮唑盐(MTT)，南京大冶生物科技有限公司;胎牛血清(FBS，批号:8131652)，GIBCO;促肝细胞生长因子(HGF，批号:20100401)，广东省药物研究所制药厂;寡聚原花色素(OPC)，本实验室自山楂中提取。

肝癌细胞HepS细胞株由中科院上海药物研究所提供，江苏省肿瘤研究所培养传代，本实验室冻存;小鼠肉瘤S180腹水型肿瘤细胞为本实验室冻存。

清洁级昆明种小鼠，雌性，22～35 g，购于南京医科大学实验动物中心，合格证号:SCXK(苏)2008-0004。

KQ-250DE型数控超生波清洗器，昆山市超声仪器有限公司;UV-9100型紫外可见近红外分光光度计，北京瑞利分析仪器公司;DG5033A酶联免疫检测仪，南京华东电子集团医疗装备有限公司生产;CO2培养箱，Thermo Forma公司;DY-1001S型电泳仪，南京大学仪器厂;JD801凝胶电泳图像分析仪，南京捷达公司。

2 方法

2.1 板栗蛋白(CAS)的提取纯化

板栗破壳去皮，以料水比1∶4打碎，超声处理1 h后过滤，滤渣重复操作一次，两次滤液合并，经乙醇沉淀，弃上清，沉淀用水溶解后7 000 r/min离心10 min，留上清，重复离心3次，收集上清液，加入(NH4)2SO4沉淀蛋白质，充分沉淀后，沉淀物用7 000 r/min离心15 min，弃上清，沉淀用水溶解后装透析袋透析;收集透析内液，6 000 r/min离心10 min，收集上清，沉淀用水溶解后重复离心3次，合并上清液过大孔树脂，水洗脱，收集的流出液再上纤维素柱，分别用不同盐离子强度的0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 6.5，PBS)洗脱，收集蛋白质峰。

2.2 CAS的鉴定

提取得到的蛋白质样品进行聚丙烯酰胺凝胶垂直平板电泳［3］。

2.3 细胞体外增殖研究

2.3.1 CAS对正常小鼠肾细胞体外增殖的促进作用 无菌条件下，取正常小鼠肾脏于加有D-HK的培养皿中，剪碎，以1∶1比例加入胰蛋白酶，37℃消化30 min，DMEM终止消化，离心去红细胞，再用培养液离心(1 500 r/min，5 min)洗两次，用含有20%FBS的DMEM配制成肾细胞浓度为1×105/mL的细胞悬液，分别加入到2块96孔板中，每孔80 μL。每块板均设一个无细胞空白对照孔(加入DMEM 160 μL);DMEM阴性对照组和HGF阳性对照组(终浓度为 20 μg/mL)［4］，每组 8 个复孔;CAS 组 5个浓度，终浓度分别为 1，5，10，20，40 μg/mL，每组16个复孔。培养板置于37℃，5%CO2培养箱中培养。培养24和48 h后各取一块板，加入5 mg/mL MTT溶液 100 μL/孔，继续培养，4 h 后加入 20%SDS溶液 40 μL/孔，次日用酶标仪测定570 nm波长处的吸光度(A)值。重复3次，每组的复孔取平均值。

2.3.2 CAS对肿瘤细胞的体外增殖的抑制作用

2.3.2.1 CAS对肝癌细胞HepS体外增殖的抑制作用 无菌条件下取接种7～10 d的HepS瘤源小鼠的腹水，DMEM离心(1 500 r/min，5 min)洗涤两次，用含20%FBS的DMEM配制成肝癌细胞HepS的浓度为1×106/mL的细胞悬液，分组及测定方法同2.3.1项，阳性对照组为OPC(终浓度为40 μL/mL)［5］，CAS 组终浓度为 10，20，40，80，160 μg/mL。

2.3.2.2 CAS对小鼠肉瘤S180体外增殖的抑制作用 配制成小鼠肉瘤S180细胞悬液的浓度为1×105/mL，按2.3.2.1项下操作。

2.4 CAS对免疫细胞增殖的促进作用

2.4.1 CAS对T细胞增殖的促进作用 无菌条件下，取正常小鼠胸腺，碾碎，离心去红细胞，DMEM(1 500 r/min，5 min)离心洗两次，配制成T细胞浓度为5 ×106/mL，接种到 96 孔板，80 μL/孔，设置一个不加细胞的空白孔(加入DMEM 160 μL)。设5个浓度的CAS组，每组16个复孔，加入相应浓度的CAS 80 μL，终浓度分别为 5，10，20，40，80 μg/mL，另设DMEM阴性对照组，OPC阳性对照组(浓度为40 μg/mL)［5］，各 8 个复孔。其余操作同 2.3.1 项。

2.4.2 CAS对B细胞增殖的促进作用 无菌条件下，取正常小鼠脾脏，按2.4.1项下方法操作，B细胞浓度为 5×106/mL，CAS组终浓度为 10，20，40，80，160 μg/mL。

2.5 DNA凝胶电泳法测定CAS对肝癌细胞HepS凋亡的影响

参照林科等［6］的方法进行。

3 结果与分析

3.1 CAS结构的鉴定

用含高盐离子强度的PBS洗脱时几乎没有蛋白质峰，故只将含有低盐离子强度的PBS洗脱的洗脱液经脱盐处理，浓缩得到CAS样品［7］，占果实总质量的0.424%。

得到的CAS经聚丙烯酰胺凝胶垂直平板电泳，得到6条带，其中最下面的三条比较清楚(图1)并进行了结构分析，结果表明这三条带为同一种蛋白质，并确定为欧栗球蛋白，分子质量62 452，由542个氨基酸组成(图2)。

图1 聚丙烯酰胺凝胶垂直平板电泳Fig.1 Vertical slab polyacrylamide gel electrophoresis

图2 欧栗球蛋白分子结构Fig.2 Molecular structure of Castanin

3.2 CAS体外对肾细胞增殖的促进作用

CAS和HGF均有促进肾细胞增殖的作用，见表1。与DMEM组比较有显著差异，结果表明CAS在体外能够促进肾细胞的增殖。

表1 CAS对小鼠肾细胞体外增殖的影响(n=3，±s)Tab.1 Promotion of CAS on mouse renal cells proliferation(n=3，±s)

表1 CAS对小鼠肾细胞体外增殖的影响(n=3，±s)Tab.1 Promotion of CAS on mouse renal cells proliferation(n=3，±s)

与 DMEM 组比较:1P＜0.05，2P＜0.01，3P＜0.001Compared with DMEM group:1P ＜0.05，2P ＜0.01，3P ＜0.001

组 别 浓度/(μg/mL)A 值24 h 48 h DMEM组0.113±0.061 0.149±0.049 HGF组 20 0.174±0.0541 0.211±0.0711 CAS组 1 0.249±0.0743 0.206±0.0901 5 0.164±0.0651 0.205±0.0771 10 0.172±0.0811 0.207±0.0791 20 0.182±0.0931 0.207±0.0841 40 0.207±0.1062 0.221±0.0891

3.3 CAS对肿瘤细胞增殖的抑制作用

CAS和OPC均能抑制肝癌细胞HepS和小鼠肉瘤细胞S180的增殖见表2～3。与DMEM组相比，有非常明显差异(P＜0.01)，在HepS中当CAS浓度达到20 μg/mL以及以上浓度时差异更加显著(P＜0.001)。在S180细胞上这种差异表现的也是异常显著(P＜0.001)，结果表明 CAS对肝癌细胞HepS和小鼠肉瘤细胞S180的增殖有抑制作用。

表2 CAS对小鼠肝癌HepS细胞增殖的影响(n=3，±s)Tab.2 Inhabition of CAS on mouse hepatoma cell HepS proliferation(n=3，±s)

表2 CAS对小鼠肝癌HepS细胞增殖的影响(n=3，±s)Tab.2 Inhabition of CAS on mouse hepatoma cell HepS proliferation(n=3，±s)

与对照组比较:1P＜0.01，2P＜0.001Compared with DMEM group:1P ＜0.01，2P ＜0.001

组 别 浓度/(μg/mL)A 值24 h 48 h DMEM组0.687±0.056 0.528±0.043 OPC组 40 0.598±0.0562 0.490±0.0881 CAS组 10 0.536 ±0.0622 0.462±0.0611 20 0.495±0.0742 0.384±0.0962 40 0.429±0.0822 0.376±0.0432 80 0.382±0.0792 0.247±0.0612 160 0.394±0.0622 0.233±0.0812

表3 CAS对小鼠肉瘤S180腹水型肿瘤细胞增殖的影响(n=3，±s)Tab.3 Inhibition of CAS on proliferation of S180 mouse sarcomaasides tumor cells(n=3，±s)

表3 CAS对小鼠肉瘤S180腹水型肿瘤细胞增殖的影响(n=3，±s)Tab.3 Inhibition of CAS on proliferation of S180 mouse sarcomaasides tumor cells(n=3，±s)

与对照组比较:1P＜0.001Compared with DMEM group:1P＜0.001

组 别 浓度/(μg/mL)A 值24 h 48 h DMEM组0.720±0.038 0.915±0.055 OPC组 40 0.541±0.0271 0.527±0.0231 CAS组 10 0.637±0.0521 0.683±0.0731 20 0.646±0.0541 0.789±0.0741 40 0.645±0.0501 0.791±0.0561 80 0.640±0.0511 0.792±0.0461 160 0.600±0.0541 0.568±0.0781

3.4 CAS对免疫细胞体外增殖作用的影响

CAS和OPC在体外对免疫细胞的增殖有促进作用，见表4～5。结果表明，与DMEM组相比，CAS对免疫细胞的增殖有较显著的促进作用。

3.5 DNA凝胶电泳法测定CAS对肝癌细胞HepS凋亡的影响

实验结果表明(图3)，160 μg/mL没有小分子质量的DNA片段，显示大部分细胞已死亡;其他5组与空白对照组相比，有较多的小分子DNA条带且形成“Ladder”，大分子质量较少，说明细胞内的大部分DNA已降解成分子质量为核小体整数倍的DNA梯形片段，而对照组主要为大分子DNA。结果表明4个剂量的CAS及阳性对照OPC对肝癌细胞HepS的凋亡有显著促进作用。

表4 CAS对小鼠T细胞体外增殖的影响(n=3，±s)Tab.4 Effect of CAS on mouse thymus cells proliferation(n=3，±s)

表4 CAS对小鼠T细胞体外增殖的影响(n=3，±s)Tab.4 Effect of CAS on mouse thymus cells proliferation(n=3，±s)

与对照组比较:1P＜0.05，2P＜0.01，3P＜0.001Compared with DMEM group:1P ＜0.05，2P ＜0.01，3P＜0.001

组 别 浓度/(μg/mL)A 值24 h 48 h DMEM组0.167±0.005 0.073±0.011 OPC组 40 0.582±0.0263 0.408±0.0193 CAS组 5 0.174±0.0121 0.090±0.0131 10 0.195±0.0162 0.086±0.0102 20 0.195±0.0271 0.088±0.0102 40 0.177±0.0191 0.087±0.0102 80 0.175±0.0221 0.087±0.0141

表5 CAS对小鼠B细胞体外增殖的影响(n=3，±s)Tab.5 Effect of CAS on mouse spleen cells proliferation(n=3，±s)

表5 CAS对小鼠B细胞体外增殖的影响(n=3，±s)Tab.5 Effect of CAS on mouse spleen cells proliferation(n=3，±s)

与对照组比较:1P＜0.05，2P＜0.01，3P＜0.001Compared with DMEM group:1P ＜0.05，2P ＜0.01，3P＜0.001

组 别 浓度/(μg/mL)A 值24 h 48 h DMEM组0.315±0.085 0.363±0.025 OPC组 40 0.737±0.0633 0.685±0.0503 CAS组 10 0.358±0.0901 0.454±0.0533 20 0.382±0.1111 0.503±0.0303 40 0.400±0.1142 0.567±0.0433 80 0.395±0.1282 0.679±0.0533 160 0.318±0.177 0.617±0.0483

图3 DNA凝胶电泳Fig.3 Map of DNA agarose gel electrophoresis

4 讨论

CAS经聚丙烯酰胺凝胶垂直平板电泳后，出现6条带，而后三条带着色深且带宽，说明在板栗蛋白溶液中该类蛋白的含量占绝大部分，是发挥作用的主要蛋白质，之后的结构分析证明，这三条带均为同一种蛋白质，这可能是由于电泳时使用β-巯基乙醇加热处理样品而造成亚基断裂使蛋白处于还原状态所致。

体外实验表明，板栗蛋白对肾脏细胞的增殖有明显的促进作用，其是否预示该蛋白对体内肾脏器官也能起到保护作用，其体内实验以及作用机制还有待进一步研究。

CAS对HepS，S180的增殖有显著的抑制作用。DNA凝胶电泳的结果表明，CAS抑制HepS细胞增殖的机制可能是，在低浓度时引起细胞凋亡，高浓度时直接产生细胞毒作用造成细胞死亡。实验说明CAS在体外具有显著的抗肿瘤活性，其可能机制是通过引起细胞凋亡而产生作用。

CAS对免疫细胞的增殖有明显的促进作用，这一结果是否也预告我们，该蛋白在体内具有增强机体免疫功能的作用，还有待我们下一步实验来证实。

本实验只是初步研究，需要进一步探究CAS抗肿瘤的作用靶点，以及是否对免疫器官也发挥作用，为合理、深入开发利用板栗蛋白提供科学依据。

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