PGC－1α在海人酸（KA）诱导培养大鼠海马神经元氧化应激损伤中的作用

唐海燕 杜 鹏 李 鑫 林豪杰 刘剑英 马 昱 范 薇 汪 昕，3△

（1复旦大学附属中山医院神经内科 上海 200032；2上海中医药大学附属曙光医院脑病科 上海 201203；3复旦大学医学神经生物学重点实验室 上海 200032）

过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活子（peroxisome proliferator－activated receptor－γcoactivator，PGC－1α）是调节线粒体生物合成的重要因子［3］。PGC－1α参与调控线粒体呼吸链：激活线粒体转录因子如核呼吸因子（nuclear respiratory factor，NRF）1和2，激活线粒体转录因子A并与之相互作用，调控线粒体关键酶的复制，启动线粒体基因的复制和转录［4］。PGC－1α在防止过氧化应激、维持线粒体基因正常功能和稳定性过程中发挥重要的作用［5］。

本研究主要通过分子生物学技术调控离体培养大鼠海马神经元PGC－1α表达，借助生化测定法检测乳酸脱氢酶（lactic dehydrogenase，LDH）活性变化及FJB染色以期观察PGC－1α基因表达水平对海人酸（kainic acid，KA）刺激后海马神经元损伤的影响；生化测定法检测SOD活性和GSH含量变化，观察PGC－1α基因表达水平对KA刺激后神经元氧化应激损伤的影响，有助于了解PGC－1α与海马神经元损伤的关系。

材料和方法

仪器试剂Neucleofector电转染仪和电转染液（Amaxa Biosystems公司），一次性无菌电转杯（德国Fisher公司）。DMEM、Neurobasal培养基（不含 L－glutamine）、F12、B27和胎牛血清（美国Gibco公司），GSH检测试剂盒（美国Calbiochem公司），LDH检测试剂盒（美国Stanbio公司），Fluoro Jade B 染 色 试 剂 盒 （美 国 Chemicon 公 司），Glutamine、DAPI染色液（美国Sigma公司）。PGC－1αshRNA质粒由中国科学院神经科学研究所李帅博士惠赠。

原代海马神经元培养、电穿孔细胞转染和KA刺激选用17天胚胎SD大鼠的海马神经元原代培养。深麻醉孕鼠，无菌状态下剖腹取胎鼠，将其放入HBSS液中清洗以去除血迹，并在解剖显微镜下取胎鼠海马组织，去除脑膜和血管，应用0．125%胰酶置于细胞培养箱中消化12min，用含胎牛血清的细胞培养液（DMEM＋10%胎牛血清＋10%F12）终止消化，轻轻吹打至悬液中无明显的组织块；静置3～5min；吸出部分上清液，将细胞悬液转移到装有培养液的EP管内稀释，3 000r／min离心3min，弃上清，迅速用含有约2μg质粒（分别为PGC－1α shRNA质粒和空载体质粒对照）的100μL电转液稀释细胞沉淀，轻轻吹打使其悬浮并混匀；转移入2mm一次性无菌电转杯中，插入电转仪内的电转槽中，选用O－03程序进行电转染。结束后迅速将细胞悬液吸出，并用1mL细胞培养液稀释，应用细胞计数板在倒置显微镜下计数细胞，以106／cm2的密度接种在铺有0．8cm×0．8cm小盖玻片的培养皿中（盖玻片已用多聚赖氨酸包被）。4h后待细胞贴壁后，换神经元维持培养液（含有DMEM、Glutamine、B27），置细胞培养箱内培养。培养7天后，用0．1μg／L KA刺激24h，空白对照组神经元培养皿中仅加入同体积生理盐水。

生化测定

GSH含量检测 参照GSH检测试剂盒说明，细胞收集后置于500μL冰偏磷酸中，平衡后4℃、3 000r／min离心10min，取150μL上清液与溶液3混匀，终体积为900μL，先后加入各50μL溶液1和溶液2，25℃下避光孵育10min，分光光度计检测400 nm波长下的吸收度（溶液1～3为试剂盒自带）。

SOD和LDH活性检测 细胞收集后置于冰生理盐水中，平衡后4℃、10 000r／min离心40min，收集沉淀用于检测SOD和LDH活性。SOD活性检测参照 Marklund等［6］方法，吸收波长为420nm；LDH活性检测参照Lowry等［7］的方法，吸收波长为340nm。

海马神经元损伤检测 FJB染色参考Schmued等［8］的方法。弃去培养液，1×PBS清洗后，0．06%高锰酸钾孵育15～20min，0．000 4%Fluoro jade B孵育20min。100ng／mL DAPI染色液直接滴加至玻片上，染色10min，流水冲去染液，滤纸吸除多余水分，加一滴荧光封片液（0．5mol／L碳酸盐缓冲液与甘油等体积混合，pH 9．5），置于荧光显微镜下观察，激发波长360～400nm。

统计分析应用Image－Pro PIus 6．0软件进行阳性染色细胞计数，数据统计采用SPSS13．0软件进行多组间方差分析及两组间t检验，方差不齐数据组用Kruskal－Wallis秩和检验，P＜0．05为差异有统计学意义。

结 果

培养海马神经元GSH含量、SOD和LDH活性的生化检测KA刺激后24h，培养海马神经元GSH 含量为（5．74±0．54）μmol·L－1·μg－1protein，较空白对照组显著降低［（9．38±0．72）μmol·L－1·μg－1protein，图1，P＜0．01］；SOD活性为（10．57±1．25）U／mg protein，较空白对照组也显著降低［（23．12±3．23）U／mg protein，图2，P＜0．01］；而培养海马神经元LDH活性为（2．21±0．18）mmol NADH，H＋／min／100mg protein，较空白对照组显著增高 ［（1．29±0．09）mmol NADH，H＋／min／100mg protein，图3，P＜0．01］。

图1 转染PGC－1αshRNA质粒下调PGC－1α基因表达对KA刺激24h后培养大鼠海马神经元GSH含量变化的影响Fig 1 The effect of PGC－1αdown－regulation on the content of GSH after KA stimulation in the cultured rat hippocampal neuron for 24hTransferred with PGC－1αshRNA，the content of GSH in PGC－1αShRNA group（n＝11）was much less than that in KA control group （vs．Control group，（1）P ＜0．01，（2）P ＜0．05，n＝10）．

图2 转染PGC－1αshRNA质粒下调PGC－1α基因表达对KA刺激24h后培养大鼠海马神经元SOD活性变化的影响Fig 2 The effect of PGC－1αdown－regulation on the activity of SOD after KA stimulation in the cultured rat hippocampal neuron for 24hTransferred with PGC－1αshRNA，the activity of SOD in PGC－1αShRNA group was much less than that in KA control group（vs．Control group，（1）P ＜0．01，（2）P ＜0．05，n＝10）．

转染 PGC－1αshRNA 质粒下调PGC－1α 基因表达，KA刺激后24h培养海马神经元GSH含量、SOD活性分别为（3．37±0．42）μmol·L－1·μg－1protein和（4．54±0．91）U／mg protein，和KA对照组比较明显降低（图1～2，P均＜0．05）；LDH 活性为（2．74±0．19）mol／NADH＋／min／mg protein，较KA对照组显著增加（图3，P＜0．01）。

图3 转染PGC－1αshRNA质粒下调PGC－1α基因表达对KA刺激24h后培养大鼠海马神经元LDH活性变化的影响Fig 3 The effect of PGC－1αdown－regulation on the activity of LDH after KA stimulation in the cultured rat hippocampal neuron for 24hTransferred with PGC－1αshRNA，the activity of LDH in experiment group（n＝11）was much more than that in KA control group（vs．Control group，（1）P ＜0．01，（2）P ＜0．05，n＝11）．

海马神经元损伤检测FJB（绿色荧光）和DAPI（蓝色荧光）染色结果显示转染PGC－1αshRNA质粒下调PGC－1α基因表达不会导致海马神经元损伤；KA刺激后24h，转染PGC－1αshRNA质粒下调PGC－1α基因表达导致的损伤较转染空载体质粒组明显增加（图4A为FJB绿色荧光和DAPI蓝色荧光染色结果；图4B为统计分析结果，P＜0．05）。

图4 培养大鼠海马神经元FJB和DAPI染色结果（×40）Fig 4 The effect of PGC－1αdown－regulation on the neuronal injury after KA stimulation in the cultured rat hippocampal neuron（×40）Transferred with PGC－1αshRNA，the neuronal injury induced by KA was much more severe than that in vehicle control group（P＜0．05）．

讨 论

PGC－1α是调控线粒体生物合成和呼吸链的重要因子，在能量合成和防止过氧化应激、维持线粒体基因正常功能和稳定性过程中发挥重要作用［10］。体外实验显示缺氧刺激时PGC－1α通过调节线粒体内皮细胞解偶联蛋白2（uncoupling protein2，UCP2）和UCP3表达抑制活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）生成，同时 ROS生成也刺激细胞PGC－1α表达，PGC－1α表达上调减少过氧化刺激体外培养成纤维细胞损伤［11］。损伤后 PGC－1α过表达可以通过调节神经元线粒体密度、减少线粒体丢失继而减轻神经元损伤［12］。研究显示，小鼠缺血缺氧后6h大脑皮层PGC－1α表达升高，24h达到高峰，后逐渐下降［13］，海马神经元损伤增加；我们前期研究观察到在KA腹腔注射后鼠海马脑区PGC－1α表达具有相似趋势。有研究表明细胞损伤时PGC－1α的表达变化受环磷酸腺苷反应元件结合蛋白 （cAMP responsive element binding protein，CREB）信号通路调控［14］；鼠脑缺血缺氧状态下神经元型一氧化氮合酶（neuronal nitric oxide synthase，nNOS）的 活 化 对 CREB－PGC－1α 通 路 具 有 激 活作用［15］。

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