鲍曼不动杆菌耐药性与16S rRNA甲基化酶基因表达相关性研究

刘振茹，凌保东，2△

(1.川北医学院药物研究所，四川 南充 637007;2.成都医学院，四川 成都 610500)

鲍曼不动杆菌耐药性与16S rRNA甲基化酶基因表达相关性研究

刘振茹1，凌保东1，2△

(1.川北医学院药物研究所，四川 南充 637007;2.成都医学院，四川 成都 610500)

目的:了解鲍曼不动杆菌对临床常用药物耐药性与16S rRNA甲基化酶基因表达水平之间的相关性。方法:从2008年9月至2011年1月收集的110株鲍曼不动杆菌，琼脂二倍稀释法测定其对21种药物(包括6种氨基糖苷类药物)的敏感性。PCR法检测7种甲基化酶基因(armA、rmtA-rmtE、npmA)，RT-PCR检测甲基化酶基因armA的mRNA表达水平。结果:鲍曼不动杆菌对氨基糖苷类的耐药率在58.2%～83.8%之间，且MIC值多在512.0 μg/mL以上。对多粘菌素B敏感率100%，其余药物耐药率在43.6%～93.6%之间。armA基因检出率为36.4%(40株)，其余基因未检出。RT-PCR结果显示，armA基因在高水平耐氨基糖苷菌株中有mRNA的表达。结论:鲍曼不动杆菌对氨基糖苷类药物的高度耐药性与16S rRNA甲基化酶基因的表达有关。

鲍曼不动杆菌;16S rRNA甲基化酶;RT-PCR

近年来有学者将常见的多重耐药菌归为“ESKAPE”病原菌，其中“A”即代表鲍曼不动杆菌［1－2］。该菌也在近十年来逐渐成为常见的医院内感染非发酵革兰阴性杆菌［3］，作为一种重要的条件致病菌，以其高检出率和高耐药率越来越引起高度关注［4］。

鲍曼不动杆菌对氨基糖苷类药物的高水平耐药逐渐成为研究热点。16S rRNA甲基化酶作为一种新型耐药机制，它可以介导对氨基糖苷类药物的高水平耐药。MIC值往往高达512.0～1 024.0 μg/mL［5］。迄今已发现7种甲基化酶基因，呈现出全球性的播散趋势［6－12］。

为了解川东北地区鲍曼不动杆菌临床分离株甲基化酶基因的存在情况，探讨它们的存在与表达在氨基糖苷类药物高水平耐药中的作用，本实验通过PCR法检测7种甲基化酶基因(armA、rmtA-rmtE、npmA)，并运用RT-PCR检测armA mRNA的表达水平，分析其与耐药性间的关系，以期为了解鲍曼不动杆菌耐药性的形成及临床医师合理应用抗菌药物提供实验室依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源收集2007年9月至2011年1月川北医学院附属医院和附属南充市中心医院临床分离的非重复鲍氏不动杆菌110株，菌株均经法国Bio-Merieux公司Vitek32全自动微生物分析系统鉴定。

1.1.2 质控菌株铜绿假单胞菌ATCC27853、大肠埃希菌ATCC25922由四川抗生素工业研究所提供，鲍氏不动杆菌标准菌株ATCC19606购自美国ATCC菌种库。

1.1.3 抗菌药物庆大霉素购自宜昌人福药业有限责任公司;链霉素购自山东鲁抗药业股份有限公司;阿米卡星购自江苏吴中实业股份有限公司;妥布霉素、卡那霉素、奈替米星、加替沙星均购自上海信然实业有限公司;头孢西丁购自深圳信立泰药业有限公司;头孢哌酮/舒巴坦、头孢哌酮购自哈药集团制药总厂;头孢吡肟购自山东罗欣药业股份有限公司;诺氟沙星购自河南康泰制药集团公司;左氧氟沙星购自山西威奇达药业药业有限公司;氯霉素购自南京白敬宇制药公司;氨曲南购自山西威奇达药业药业有限公司;四环素购自上海生物工程技术有限公司;米诺环素购自地奥集团成都药业股份有限公司;美罗培南购自住友制药株式社;环丙沙星、亚胺培南、多粘菌素B均购自Sigma公司。

1.1.4 化学试剂First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒:TOYOBO公司;2×Taq PCR MasterMix、DNA Marker、DNA纯化回收试剂盒(离心柱型)、总RNA提取试剂盒(离心柱型)、溶菌酶、DEPC:北京天根生化科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 药敏试验采用琼脂二倍稀释法测定21种抗菌药物对110株鲍氏不动杆菌的最低抑菌浓度(MIC);结果判定参照2010年CLSI(clinical and laboratoy standards institue，CLSI)公布标准，以敏感(S)、中介(I)、耐药(R)记录实验结果。

1.2.2 PCR扩增甲基化酶基因以阿米卡星MIC≥256 μg/mL，将110株细菌分为氨基糖苷类高水平耐药组(60株)和相对低水平耐药组(50株)。挑取单个菌落于25 μL无菌水中，95℃15 min，10 000 r/min离心5 min，取上清液作为模板。委托上海生工设计与合成引物，PCR反应体系及条件如下:2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，上、下游引物分别为1 μL，模板DNA2 μL，超轻水(DDW)8.5 μL，共25 μL，稍离心混匀。94℃预变性5 min，循环参数为:94℃变性l min，退火30 s，72℃延伸l min，共进行30℃次循环，72℃延伸7 min。纯水为空白对照。退火温度通过梯度PCR方法确定，除扩增armA时用58℃外，其余均使用55℃。1%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，凝胶成像系统观察电泳结果，并照相。

1.2.3 RT-PCR检测甲基化酶armA基因mRNA水平表达(1)提取细菌总RNA:取1 mL菌液离心留沉淀，加入TE缓冲液(pH8.0)含有0.8 μL溶菌酶(50.0 mg/mL)100 μL吹打混匀，孵育3～5 min。加入350 μL裂解液RL，漩涡振荡混匀，离心2 min，取上清液转移至离心管中。加入250 μL无水乙醇，混匀，转入吸附柱CR3中，离心弃废液，加350 μL去蛋白液RW1，离心弃废液，加80 μL的DNase I工作液于吸附柱中CR3中，室温静置约15 min。加入350 μL去蛋白液RW1，离心弃废液，加500 μL去漂洗液RW(已加入乙醇)，室温放置2 min，离心弃废液，室温放置数分钟。将吸附柱CR3转入新的RNase-free离心管中，悬空滴加35 μL RNase-free ddH2O，室温放置2 min，12 000 rpm离心2 min，得到RNA溶液。(2)RNA逆转录cDNA:操作均在冰上制备:取总RNA 0.1～1 μg，1 μL随机引物，RNasefree ddH2O配制成12 μL混合物，稍离心，65℃孵育5 min，立即冰上冷却即为变性RNA溶液。加样顺序，取变性后RNA溶液12 μL，5×RT buffer 4 μL，10mM dNTP Mixture 2 μL，RNase Inhibitor1 μL，Rever Tra Ace 1 μL，总体积为20 μL，瞬时离心。按以下条件进行逆转录反应，30℃孵育10 min，42℃孵育20 min，99℃孵育5 min，4℃5 min终止反应。(3)PCR扩增:目的基因分别用表1中引物armAP1/P2，AdeB-P1/P2，16SrRNA-P1/P2进行PCR扩增，扩增体系及条件:2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，上、下游引物分别为1 μL，模板cDNA 2 μL，超轻水(DDW)8.5 μL，共25 μL，稍离心混匀。循环参数设置同前。扩增结束后用2%琼脂糖凝胶电泳进行分离并观察PCR产物。

表1 鲍曼不动杆菌PCR引物序列

1.3 统计学分析

显著性比较采用SPSS13.0软件进行t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 药敏试验结果

110株鲍曼不动杆菌对氨基糖苷类的耐药率在50.1%～83.8%之间，对多粘菌素B最敏感，敏感率为100%，其次为亚胺培南和美罗培南，耐药率分别为8.2%和9.1%，其余药物耐药率在43.6%～93.6%之间，耐药情况严重(表2)。

表2 21种抗菌药物对鲍曼不动杆菌的体外活性(n=110)

鲍曼不动杆菌氨基糖苷类药物MIC值构成比。对氨基糖苷类耐药的菌株其MIC值较高，多在256.0 μg/mL及以上，对该类抗生素呈现较高水平的耐药性，其MIC≥256.0 μg/mL的比例在46.4%～65.4%之间(表3)。

表3 6种氨基糖苷类抗生素MIC值(≥256 μg/mL)百分比

2.2 16s rRNA甲基化酶基因检测结果

在对氨基糖苷类高水平耐药组中，66.7%的菌株(40/60)检测到armA，其余6种甲基化酶基因未检出。而在低水平耐药组中7种甲基化酶基因均未检出。部分阳性结果，见图1。

2.3 RT-PCR结果

在高水平耐药组中，armA基因扩增阳性的菌株选用6个样本，由于相对低水平耐药组中armA检测为阴性结果，因此未对低水平组进行本步操作。结果显示在高水平耐药组中全部扩增出与目的基因和16S内参照基因条带大小相似的片段，利用凝胶成像分析系统扫描并照相，由于armA基因只在对氨基糖苷类药物高水平耐药组中表达，故未对其进行灰度值扫描和统计分析，结果见图2。

3 讨论

鲍曼不动杆菌已经成为引起院内感染重要的病原菌之一。我们检测了鲍曼不动杆菌对21种抗菌药物的耐药情况，从药敏结果来看，其对氨基糖苷类药物的耐药率均在50%以上，对阿米卡星的耐药率最低为50.1%，高于国外学者Adams等［13］报道的阿米卡星耐药率为36.7%，这可能与国内外抗生素使用习惯差异等因素有关，本研究还发现对6种氨基糖苷类药物的MIC≥256.0 μg/mL的百分比较高，在46.4%～65.4%之间，呈现出较高水平的耐药。对头孢菌素类、氟喹诺酮类、氯霉素的耐药情况也相当严重，对碳青霉烯类亚胺培南、美洛培南的耐药较低，耐药率分别为为8.2%和9.1%，但多粘菌素B表现出最好的抗菌活性，敏感率为100%，这说明本地区鲍曼不动杆菌耐药性严重，尤其对氨基糖苷类药物多呈现高水平耐药，提示在临床用药前应做药敏试验，合理使用或联合用药，以期对鲍曼不动杆菌感染性疾病得到有效治疗。

研究显示鲍曼不动杆菌对氨基糖苷类耐药的主要原因是产生了氨基糖苷钝化酶［14］，可将其分为乙酰转移酶(AAC)、核苷转移酶(ANT)和磷酸转移酶(APH)三类共30余种。由于其编码产生的酶底物特异性各不相同，一般只能介导一种或几种结构相似的氨基糖苷类抗生素耐药性的产生［15］。如AAC(6')-I作用底物为卡那霉素、妥布霉素、奈替米星、阿米卡星及新霉素等;ANT(3″)-Ⅰ介导链霉素及壮观霉素耐药;APH(3')-Ⅵ可修饰大多数的氨基糖苷类药物［16］。而质粒介导的16S rRNA甲基化酶是一种较新的耐药机制，能够使细菌对4，6-二取代基脱氧链霉胺类氨基糖苷抗生素高水平耐药。如耐卡那霉素、妥布霉素、阿米卡星、阿贝卡星、庆大霉素、西梭米星及异帕米星［17］。

本研究首次报道了川东北地区鲍曼不动杆菌产16S rRNA甲基化酶基因的流行现状。有文献报道［18］如果选用氨基糖苷类药物的MIC值，其MIC值为256.0 μg/mL可提供较好的阳性预测价值，单用阿米卡星可达到60%，如果加用阿贝卡星可使其阳性预测值＞90%。由于阿贝卡星难以得到，因此我们采用以阿米卡星MIC≥256.0 μg/mL将110株鲍曼不动杆菌分为氨基糖苷类高水平耐药组(60株)和低水平耐药组(50株)，我们观察到在60株高水平耐药鲍曼不动杆菌中有40株细菌检出armA基因，阳性率66.7%，与潘树根等［19］的研究结果相似，介导了对6种氨基糖苷类药物的高度耐药(MIC≥512.0 μg/mL)，在阿米卡星MIC≥512.0 μg/mL的菌株中，大部分都存在armA基因，这与周颖杰等［20］的研究结果相符。另外，我们在高水平耐药组选用6株armA基因阳性菌株进行RT-PCR分析其mRNA表达情况，结果显示在高水平耐药组中，armA基因在6株细菌中mRNA均有表达，这也进一步说明了16S rRNA甲基化酶的产生可导致对氨基糖苷类产生较高水平的耐药。

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Study on the correlation between antibiotic resistance and 16SrRNA methylase in acinetobacter baumannii

LIU Zhen-ru1，LING Bao-dong1，2△
(1.Institute of Materia Medica，North Sichuan Medical College，Nanchong 637007;2.Chengdu Medical College，Chengdu 610500，Sichuan，China)

Objective:To survey the the correlation between antibiotic resistance and 16SrRNA methylase in Acinetobacter baumannii.MethodsA total of 110.Acinetobacter baumanii isolates were collected from September 2008 to January 2011 in Northeastern Sichuan.The sensitivity of the isolates to 21 commonly used antimicrobial agents was determined by using agar dilution method.The 16S rRNA methylase genes(armA，rmtA-rmtE，and npmA)were analyzed by polymerase chain reaction(PCR).Using RT-PCR methord to determin the mRNA expressions of genes in some strains，and analyze the difference of mRNA expression level.Results:Of the 110 Acinetobacter baumannii isolates，58.2～83.8%of isolates were highly resistant to aminoglycoside(MIC＞512.0μg/mL)，All of the isolates(100%)were sensitive to Polymyxin B.The resistant rates to other commonly used durgs were variable(range 43.6%～93.6%).The armA gene were present in 36.4%of the 110 clinical isolates，the rest was not detected.It was shown by RT-PCR that in the high-level resistance group the selected strains were amplified with armA.ConclusionThe 16S rRNA methylase armA gene was relative to the high-level resistance to aminoglycosides inancein Acinetobacter baumannii.

Acinetobacter baumannii;16S rRNA methylase;RT-PCR

1005-3697(2012)06-0526-05

R378;R978.1+2

A

10.3969/j.issn.1005-3697.2012.06.001

国家自然科学基金资助项目(30973662)

2012-10-02

刘振茹(1985－)，女，河北石家庄人，博士研究生，主要从事细菌耐药分子机制研究。

△通讯作者:凌保东，E-mail:baodongling@yahoo.com.cn网络出版时间:2012-11-1217∶16

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20121112.1716.023.html