酶解和碱处理对半乳糖醛酸-木素脱氢聚合物复合体结构的影响

孙 雪 谢益民 杨海涛 姚 兰 王 鹏 范建云

(湖北工业大学化学与环境工程学院，湖北武汉，430068)

化学法制浆过程中，化学药品在高温高压的条件下能使植物纤维原料中木素-碳水化合物连接键(LC键)发生断裂，从而使木素-碳水化合物复合体(LCC)中的部分木素溶出。化学法制浆技术已非常成熟，但是在节能环保方面还需改进［1］。随着人们环保意识的增强，清洁生产成为制浆造纸工业发展的最终方向，因此生物法制浆和漂白越来越受人们青睐。由于生物酶的专一性，生物酶主要起缩短LCC结构中多糖链长度作用，而不能切断LC键，单独采用生物法制浆和漂白的效果并不理想，生物法制浆和漂白技术的发展受到制约，但采用生物法对植物原料进行预处理并与化学法制浆相结合可达到很好的制浆效果［2］。

果胶是一类具有共同特性的寡糖和多聚糖的混合物，相对分子质量50000～3000000，主要存在于植物相邻细胞壁的复合胞间层，是细胞间的黏结物质［3］，主要成分是 D-半乳糖醛酸［4］。植物纤维细胞初生壁中含有大量果胶，能形成果胶-木素复合体(PLC)。研究证明，果胶和聚半乳糖醛酸能在果胶酶的作用下发生水解，利用果胶酶对植物纤维原料进行预处理，然后采用化学法制浆，所得浆料的性能好于直接用化学法制浆所得浆料的性能，且能耗低［5］。

为探讨植物纤维细胞壁中木素和果胶之间化学键的连接及其化学和生化降解机理，本实验首先利用果胶结构单元D-半乳糖醛酸和木素前驱物松柏醇-β-D-葡萄糖苷来模拟植物体内果胶-木素复合体的形成过程，合成半乳糖醛酸-木素脱氢聚合物复合体(GDHPC)，再用酶解(果胶酶)和碱法(1 mol/L的NaOH)分别对GDHPC进行处理。利用FT-IR和13C-NMR分析这2种方法处理前后GDHPC中LC键的变化。

1 实验

1.1 GDHPC的酶催化合成

将3 g松柏醇-β-D-葡萄糖苷(实验室条件下制得)溶解在200 mL醋酸钠/醋酸缓冲溶液(pH值5.0，0.2 mol/L，下同)中，备用。将3 g D-半乳糖醛酸溶解在200 mL醋酸钠/醋酸缓冲溶液中，在无菌条件下将D-半乳糖醛酸溶液加入到6 mL溶有漆酶1731 IU(诺维信)、葡萄糖氧化酶2465 IU(Ⅱ型:源自Aspergilus niger，Sigma)、辣根过氧化物酶573 IU(Ⅱ型:源自Horseradish，Sigma)、β-葡萄糖苷酶916 IU(源自almonds，Fluka)的水溶液中，均匀混合后，用恒流泵(24 h，4 mL/h)将松柏醇-β-D-葡萄糖苷溶液加入到含各种生物酶和D-半乳糖醛酸的溶液中，将体系保持在30℃下反应10 d，反应期间不断通入无菌空气。反应结束后，离心分离得到沉淀物，用蒸馏水洗涤沉淀物10次以去除各种酶、剩余的松柏醇-β-D-葡萄糖苷和D-半乳糖醛酸、醋酸钠和醋酸。将产物冷冻干燥后再加入到60 mL二氯乙烷/乙醇(体积比2∶1)溶液中，室温下搅拌0.5 h后再离心分离［6］。用二氯乙烷/乙醇溶液洗涤沉淀物3次以彻底去除没有与D-半乳糖醛酸连接的木素脱氢聚合物(DHP)，将沉淀物冷冻干燥得产物 GDHPC(300 mg)。

1.2 GDHPC的果胶酶酶解处理［7］

将150 mg GDHPC加入到30 mL溶有果胶酶450 IU(Sigma)的醋酸钠/醋酸缓冲溶液(pH值4.6)中，并加入数滴甲苯作保护剂。在50℃条件下水浴振荡2 d。反应完毕后，离心分离，并用蒸馏水洗涤沉淀物数遍后，冷冻干燥，得129 mg酶解后的半乳糖醛酸-木素脱氢化合物复合体(EDGDHPC)。

1.3 GDHPC 的碱法处理［7］

将150 mg GDHPC溶于1 mol/L的NaOH溶液中，在25℃条件下遮光搅拌12 h，期间用N2作保护剂。反应完成后，用稀盐酸调pH值至酸性，析出沉淀后离心分离，并用蒸馏水洗涤沉淀物3次，冷冻干燥，得121 mg碱处理后的半乳糖醛酸-木素脱氢化合物复合体(ADGDHPC)。

1.4 FT-IR分析

取1～2 mg样品压成KBr膜片，在Thermo Nexus 407 FT-IR红外光谱仪上进行检测。

1.513C-NMR分析

分别称取100 mg待测样品溶解在0.5 mL DMSO-d6溶剂中，置入核磁管，在Bruker AV400双通道全数字化傅里叶超导核磁共振谱仪上在100 MHz观测频率下进行碳谱扫描。实验条件为:室温，0.9 s接受时间，脉冲宽度60°，脉冲迟滞1.75 s，扫描次数20000 次［8］。

2 结果与讨论

2.1 FT-IR分析

图1为GDHPC、EDGDHPC及ADGDHPC的红外光谱图，官能团归属见表1［7-10］。。由图1和表1可知，GDHPC在1600 cm-1附近有来自苯环的吸收峰，在1424和1030 cm-1附近有来自糖类C—O的振动吸收峰。这说明DHP和D-半乳糖醛酸形成了化学键结合。分别经果胶酶酶解和碱法处理后，D-半乳糖醛酸上的羧基特征吸收峰(1732～1750 cm-1)有所减弱，特别是碱法处理后，D-半乳糖醛酸上的羧基特征吸收峰基本消失。说明酶解和碱处理都可降解GDHPC中的D-半乳糖醛酸。

图1 GDHPC、EDGDHPC及ADGDHPC的红外光谱图

图2 GDHPC、EDGDHPC及ADGDHPC的13C-NMR谱图

表2 GDHPC、EDGDHPC及ADGDHPC的13C-NMR分析

2.213C-NMR分析

图 2为 GDHPC、EDGDHPC及ADGDHPC的13C-NMR谱图，化学位移所对应的官能团归属见表2［7-10］。由图2和表2可知，GDHPC中的DHP部分主要以β-O-4(No.22 ～23)、β-β(No.17)、β-5(No.16)、β-1(No.26)结构连接，此外，还含有大量的松柏醇/醛(No.2)和少量的香草醛结构，以及Ar-CaH＝CH—(No.10)和 醚 化 5-5'结 构(No.8)。No.19(δ=80.8 ～81.9)来自D-半乳糖醛酸与DHP以苯甲醚键连接结构(见图3a)的α-C共振信号，无论是果胶酶酶解还是碱法处理，该信号的强度均没有明显减弱，说明苯甲醚键连接结构在果胶酶酶解和碱法处理过程中比较稳定。No.21(δ=73.9 ～74.1)为来自DHP与D-半乳糖醛酸以酯键形式连接的木素-碳水化合物连接键(LC键，见图3b)的α-C的共振信号，经过果胶酶酶解后，该信号强度变化不明显，说明果胶酶对于D-半乳糖醛酸和DHP之间的酯键连接很难起到切断作用。然而，经过碱法处理后，该信号几乎完全消失，说明碱法处理对于切断D-半乳糖醛酸和DHP之间以酯键形式连接的LC键非常有效。

图3 GDHPC中愈创木基型结构单元

3 结论

3.1 D-半乳糖醛酸和松柏醇β-D-葡萄糖苷在多种生物酶的作用下形成了半乳糖醛酸-木素脱氢聚合物复合体(GDHPC)。FT-IR和13C-NMR分析表明，D-半乳糖醛酸和木素脱氢聚合物(DHP)之间形成了以苯甲醚键和酯键2种形式连接的木素-碳水化合物连接键(LC键)。

3.2 碱法(1 mol/L的NaOH)处理GDHPC后，红外光谱图上的D-半乳糖醛酸的特征吸收峰明显减弱;13C-NMR分析表明，碱法处理不能使苯甲醚键型LC键发生断裂，但是可以使酯键型LC键完全断裂。因此，在碱法处理果胶含量较高的纤维原料(树皮、麻类等)时，制浆过程中通过降解酯键型LC键，使木素和果胶得到有效分离，浆料中木素和果胶残留量比较少。

3.3 果胶酶酶解GDHPC后，红外光谱图上的D-半乳糖醛酸的特征吸收峰有所减弱;13C-NMR分析表明，果胶酶酶解对苯甲醚键型和酯键型的LC键都没有明显的切断作用，所以单独用果胶酶处理果胶含量较高的纤维原料时，效果不如碱法处理明显。但果胶酶对果胶的降解，使得GDHPC的分子质量降低，易于溶出脱除，并使纤维原料结构变得疏松，提高了化学药品与纤维原料的反应性能，因此，果胶酶预处理能提高碱处理的效率。

［1］谢来苏.制浆原理与工程［M］.2版.北京:中国轻工业出版社，2005.

［2］Giovanni G S，Alessandro D，Glaudio P，et al.Characteristics of paper handsheets after combined biological pretreatments and conventional pu1ping of wheat straw［J］.TAPPI J，1994，77(6):151.

［3］杨淑蕙.植物纤维化学［M］.3版.北京:中国轻工业出版社，2001.

［4］贝特斯，旺达姆，陈代杰，等.生物高分子［M］.北京:化学工业出版社，2004:311.

［5］白延坤，刘秉钺，何连芳.果胶酶及其在制浆造纸上的应用［J］.中国造纸学报，2006，21(2):88.

［6］王 鹏，谢益民，范建云.果胶-木素复合体化学结构13C同位素示踪法的研究［J］.陕西科技大学学报，2006，10(24):17.

［7］Xie Yimin，Yasuda Seiichi，Wu Hong，et al.Analysis of the structure of lignin-carbohydrate complexes by the specific13C tracer method［J］.Journal of Wood Science，2000，46(2):130.

［8］顾瑞军.木素和木素-碳水化合物复合体的化学结构及形成机理［D］.广州:华南理工大学，2002.

［9］杨海涛.13C同位素示踪法研究木素与LCC的化学结构及形成机理［D］.广州:华南理工大学，2004.

［10］王 鹏.植物纤维的接枝共聚与酶催化交联的研究［D］.广州:华南理工大学，2007.