人胃癌细胞中HSP27高表达与长春新碱耐药的关系

孙雪峰,朱易凡,杨轶轩,何 松△

(1.重庆三峡中心医院消化内科，重庆万州 404000；2.中山大学附属第一医院普通外科，广州510080；3.重庆医科大学附属第二医院消化科 400010)

胃癌细胞的多药耐药(MDR)是胃癌患者化疗失败的主要原因[1-5]。长春新碱耐药型细胞系SGC7901/VCR源自于人类胃癌细胞系SGC7901，通过在体外使用长春新碱逐步筛选而获得，对顺铂、依托泊苷、丝裂霉素C及5-氟尿嘧啶(5-FU)等其他抗肿瘤药物呈交叉耐药,是一个广泛使用的MDR细胞模型。本研究通过对SGC7901/VCR的研究，进一步了解胃癌MDR的分子生物学机制，期待能为胃癌患者提供更有效的治疗手段。

1 材料与方法

1.1细胞系 长春新碱MDR人类胃癌细胞系SGC7901/VCR及其母细胞系SGC7901，由第四军医大学的樊代明院士赠送。

1.2主要试剂及仪器 IPG干胶条、考马斯亮蓝G-250、三Tris Base、SDS、PVDF膜、ECL购自Amersham Biosciences。HSP27、HSP90、ACTIN的单克隆或多克隆抗体购自Santa Cruz Biotechnology，双向电泳系统、图像扫描器、电喷雾-四极杆-飞行时间串联质谱仪(ESI-Q-TOF-MS)购自Micromass公司。

1.3双向凝胶电泳 用裂解液(7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，100 mmol/L DTT，4% CHAPS，40 mmol/L Tris，2%载体两性电解质，1 mg/mL脱氧核糖核酸酶Ⅰ，1 mmol/L Na3VO4和1 mmol/L PMSF)，使细胞裂解。将细胞裂解液4 ℃、15 000 r/min离心30 min,收集上清液，测定总蛋白浓度。水化液(含7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，0.2% DTT，0.5%(v/v) pH 3～10的IPG缓冲液，微量溴酚兰)将500 μg蛋白样品稀释至450 μ L，加样至IPG胶条上，然后30 V水化24 h。IEF参数为：500 V聚焦1 h，1 000 V聚焦1 h，8 000 V聚焦8.5 h，总计68 kVh。聚焦后IPG胶条使用平衡溶液(含6 mol/L尿素，2% SDS，30% 甘油，pH 8.8的50 mmol/L Tri-HCL，1%的DTT)平衡15 min，之后用同样的溶液(只是用2.5%碘乙酰胺代替上述溶液中的DTT)再平衡15 min。之后IPGphor，Ettan DALT II系统进行第二向SDS-PAGE电泳。电泳结束后G-250对双向电泳的凝胶进行染色，PDQuest系统加以分析[6]。

1.4ESI-Q-TOF-MS分析[7]剪下不同的蛋白质点迹和蛋白质条带，使用含乙腈的新配制溶液使之脱色，之后真空离心干燥。干燥后的凝胶块用10 μL胰酶溶液(含40 mmol/L NH4HCO3的9%ACN溶液和20 μg/mL蛋白质组级别的胰酶)在37 ℃下孵育10～12 h。使用Millipore Zip Tip C18纯化多肽混合物。将经过纯化的多肽混合物加样LC/MS,DDA模式进行质谱分析。质谱检测的参数：毛细管电压为3 000 V，进样锥电压为45 V，源温度为80 ℃，碰撞气体背压为15 psi。

表1 ESI-Q-TOF-MS鉴定出的差异表达蛋白质有100 mmol/L NH4HCO3的50%

a:Swiss-Prot号；b:↑表示与SGC7901相比，SGC7901/VCR有大于或等于2倍的增加。↓表示与SGC7901相比，SGC7901/VCR有大于或等于2倍的下降。

1.5数据库分析 将MS/MS产生的PKL格式的文件录入Mascot搜索引擎中。搜索参数按如下设置：质量容许误差为±1.0道尔顿；MS/MS容许误差为±0.5道尔顿；可允许有一个没有计数的剪切位点；固定修饰为半胱氨酸；可变修饰选择为氧化；数据格式选择为Micromass PKL格式；工具选择为ESI-Q-TOF。

1.6Western blot检测 使用裂解液(含50 mmol/L Tris，pH 7.4，100 mmol/L NaCl，1 mmol/L MgCl2，2.5 mmol/L Na3VO4，1 mmol/L PMSF，2.5 mmol/L EDTA，0.5% Triton X-100，0.5% NP-40)在4 ℃下将细胞裂解30 min,收取上清液,测定蛋白质浓度。SDS-PAGE电泳后，将蛋白质转移至PVDF膜上。5%脱脂奶粉的TBS缓冲液(20 mmol/L Tris，pH 7.6，100 mmol/L NaCl2，0.5%的Tween-20)阻断过夜。然后在室温下一抗溶液(5%脱脂奶粉的TBS缓冲液以1∶1 500～1∶2 000比例稀释)孵育3 h。二抗溶液(1∶3 000稀释)在室温下孵育1 h。TBS-T 3次洗脱后，ECL系统检测。所有的Western blot检测均重复3次。

1.7将HSP27的反义寡核苷酸链(ASO)导入细胞 所使用的HSP27的ASO对应HSP27的反义起始位置(5′-GGG ACG CGG CGC TCG GTC AT-3′)[8]，错义ASO为对照(5′-CAG CGC TGA CAA CAG TTT CAT-3′)。转染前1 d，将SGC7901/VCR细胞接种在6孔板和96孔板中，细胞密度为105个/mL。当细胞呈30%～50%融合时，50 nmol/L HSP27 ASO 或错义ASO转染细胞。HSP27 ASO或错义ASO转染SGC7901/VCR细胞共2 d，转染结束时，用不同浓度的长春新碱或阿霉素孵育细胞24 h。Western blot分析测定HSP27的表达水平，MTT检查SGC7901/VCR的细胞活性。

1.8免疫共沉淀(IP) 4 ℃下将细胞在免疫共沉淀缓冲液中(含20 mmol/L Tris，pH 7.4，100 mmol/L的NaCl，1% NP-40，0.5 mmol/L EDTA，0.5 mmol/L Na3VO4，0.5 mmol/L PMSF)孵育30 min使细胞裂解。收集上清液，进行免疫共沉淀。首先使用非免疫血清对1 500 μg总蛋白进行预清除。接着，将20 μg HSP27抗体与预清除的上清液在4 ℃下共孵育3 h。然后加入100 μL protein-G 琼脂糖珠子，继续孵育1 h。离心30 s后，TBS-T缓冲液洗3次,用0.1 M的氨基乙酸(pH=3)洗脱免疫复合物。SDS-PAGE电泳后考马斯亮兰R-250染色,条带胰酶消化，进行质谱分析。

2 结 果

2.1差异表达蛋白质的鉴定 通过双向电泳，将SGC7901/VCR细胞株及其对应细胞株SGC7901的总蛋白进行差异展示(图1)。与SGC7901相比，SGC7901/VCR中20 kDa大小连续3个点的表达显著性上调(表1)。ESI-Q-TOF-MS分析，并结合数据库检索。3个点均鉴定为热休克蛋白27(HSP27)。图2显示了代表性的MS/MS结果。从y-片段电子系列中的质量差异中，鉴定出m/z值为974.327 0多肽片段的氨基酸序列为GPSWDPFRDWYPHSR，该序列是HSP27序列的一部分。

图1 SGC7901长春新碱耐药的SGC7901/VCR细胞系的双向电泳图

2.2HSP27与MDR的关系 Western blot分析显示HSP27 ASO转染后HSP27的表达显著下降，错义ASO转染后，其HSP27表达没有变化(图3A)。在HSP27 ASO转染后，与不同浓度的长春新碱和阿霉素共同孵育24 h，SGC7901/VCR对长春新碱和阿霉素的化疗敏感性增强，细胞活性显著降低(图3B)。

图2 蛋白的ESI-Q-TOF-MS分析结果

A： HSP27 ASO转染SGC7901/VCR细胞显著抑制了HSP27蛋白表达水平；B： HSP27 ASO转染SGC7901/VCR细胞增强了长春新碱和阿霉素的化疗敏感性。试验重复3次。*：P≤0.05。Oligofectamine组仅用转染因子oligofectamine转染细胞。

2.3HSP27相互作用蛋白的鉴定 通过免疫沉淀和质谱分析，在HSP复合物中共鉴定出25种蛋白。根据蛋白质的功能，鉴定出的蛋白质可分为8个功能种类：细胞骨架、分子伴侣、代谢酶、信号传导相关蛋白、核糖体蛋白、DNA修复蛋白、转录翻译蛋白以及RNA加工蛋白，这些功能与HSP27复合物的功能有很好的相关性。

2.4HSP27相互作用蛋白的确认 通过IP和Western blot分析证实β-catenin、HSP90和Actin与HSP27相互作用(图4),在IgY阴性对照中则未检测到。

图4 Western blot验证HSP27的相互作用蛋白

3 讨 论

本研究发现，在长春新碱MDR的胃癌细胞系SGC7901/VCR及其母细胞系SGC7901之间，HSP27有显著性的差异表达。当SGC7901/VCR中的HSP27的过表达受到HSP27 ASO的抑制时，细胞对长春新碱和阿霉素的敏感性增加。这明确显示HSP27在SGC7901/VCR的过表达和SGC7901/VCR多药耐受表型相关。

作者进一步鉴定了25种与HSP27相互作用的蛋白，并免疫共沉淀确认了β-catenin、Actin及HSP90与HSP27的相互作用。这提示HSP27与细胞骨架蛋白(如肌动蛋白，肌动蛋白-类蛋白)形成一种复合物，参与肌动蛋白的动力学调节，防止细胞骨架因为多种应激因素而解离[9]。细胞骨架的解离是化疗药物造成细胞损伤早期的和核心的事件。化疗药物造成细胞损伤后，在细胞骨架重组期间，HSP27能与细胞骨架相互作用，而HSP27高表达进一步促进细胞细胞骨架的重组,从而逃避化疗药物杀伤。

本研究发现核糖体蛋白(包括核糖体蛋白P0和核磷蛋白)与HSP27相互作用。核磷蛋白是一种多功能蛋白，在细胞周期中，可穿梭于细胞核与细胞质之间。有学者猜测其穿梭能力与其分子伴侣活性有关[10-12]，从而在细胞分化、凋亡的过程中，发挥重要的调节作用。核磷蛋白参与肿瘤的多药耐受表型，很可能是通过抑制细胞凋亡来实现[13]。本研究表明了HSP27与核磷蛋白形成复合物，并导致耐药的直接证据。

另外，与HSP27相互作用的一些蛋白，也参与调节细胞的增殖和分化。在这些蛋白中，β-catenin是经典Wnt信号通路中的关键组成成分[14-15]。β-catenin能与α-catenin及E-cadherin相互作用，激活经典Wnt信号通路，导致干细胞存活及肿瘤产生。

本研究证实在胃癌细胞SGC7901/VCR中,细胞MDR与HSP27的高表达相关，并且提供了HSP27与MDR机制紧密相关的证据。但是，HSP27在肿瘤长春新碱耐药中的作用机制仍有难以理解之处。可能与HSP27还参与细胞信号转导、细胞增殖分化等更为复杂的过程有关。

[1]Gottesman MM,Fojo T,Bates SE.Multidrug resistance in cancer:role of ATP-dependent transporters[J].Nat Rev Cancer,2002,2(1):48-58.

[2]郭剑伟,李杰.胃癌的化疗耐药性研究进展[J].复旦学报：医学版,2002,29(4):323-325.

[3]桂贤,刘会敏.肿瘤多药耐药发生机制的研究进展[J].上海医学,2005,28(2):161-164.

[4]Yeh KH,Chen CL,Shun CT,et al.Relatively low expression of multidrug resistance-1(MDR-1) and its possible clinical implication in gastric cancers[J].J Clin Gastroenterol,1998,26(4):274-278.

[5]Fujii H,Tanigawa N,Muraoka R,et al.Clinical significance of multidrug resistance and P-glycoprotein expression in patients with gastric carcinoma[J].J Surg Oncol,1995,58(1):63-69.

[6]Candiano G,Bruschi M,Musante L.Blue silver:a very sensitive colloidal coomassie G-250 staining for proteome analysis[J].Elec-trophoresis,2004,25(9):1327-1333.

[7]Yang YX,Xiao ZQ,Chen ZC,et al.Proteome analysis of multidrug resistance in vincristine--resistant human gastric cancer cell line SGC7901/VCR[J].Proteomics,2006,6(6):2009-2021.

[8]Rocchi P,Beraldi E,Ettinger S,et al.Increased Hsp27 after androgen ablation facilitates andro-gen-independent progression in prostate cancer via signal trans-ducers and activators of transcription 3-mediated suppression of apoptosis[J].Cancer Res,2005,65(23):11083-11093.

[9]Kampinga HH,Henning RH,van Gelder IC,et al.Beat shock proteins and atrial Wbrillation[J].Cell Stress Chaperones,2007,12(2):97-100.

[10]Wu MH,Chang JH,Chou CC,et al.Involvement of nucleophosmin/B23 in the response of HeLa cells to UV irradiation[J].Int J Cancer,2002,97(3):297-305.

[11]Grisendi S,Mecucci C,Falini B,et al.Nucleophosmin and cancer[J].Nat Rev Cancer,2006,6(7):493-505.

[12]Lim MJ,Wang XW.Nucleophosmin and human cancer[J].Cancer Detect Prey,2006,30(6):481-490.

[13]Li J,Zhang X,Sejas DP,et al.Negative regulation of p53 by nucleophosmin antagonizes stress-induced apoptosis in human normal and malignant hematopoietic cells[J].Leuk Res,2005,29(12):1415-1423.

[14]Tepera SB,McCrea PD,Rosen JM.A beta-catenin survival signal is required for normal lobular development in the mammary gland[J].J Cell,2003,116(6):1137-1149.

[15]Daniels DL,Spink K,Weis WI.Beta-catenin:molecular plasticity and drug design[J].Trends Biochem Sci,2001,26(11):672-678.