葛根素注射液对大鼠急性视网膜光损伤Cyt-c,Caspase-3表达的影响

黄秀蓉 邓小红 李楠 陈莉平 刘小红 余蓉

近30年来,随着眼科光学诊疗器械应用的日益增多,人们对各种眼科光学诊疗器械光源导致的视网膜损伤等问题进行了较深入的研究。现代研究表明[2],眼科常用的诊疗器械如裂隙灯、间接检眼镜、手术显微镜等均可造成视网膜光损伤。研究表明视网膜光损伤的病理过程主要表现为视网膜光感受器细胞的凋亡[3],是一种退行性病变过程。 有学者报道,葛根素可减轻氧化损伤,抑制细胞凋亡[4]。本实验采用显微镜所致大鼠急性视网膜光损伤模型作为对象,通过视网膜病理形态学观察、组织生化学检查等手段,从形态学、生化学等方面研究葛根素注射液对视网膜急性光损伤修复的影响,并探讨其对视网膜的保护作用。

1 实验方法

1.1分组方法 48只SD大鼠购回驯养1周后,随机选取12只大鼠24眼为正常对照组(简称正常组),另36只大鼠72眼进行急性光损伤造模,造模成功后随机分为模型对照组(简称模型组)、高剂量治疗组(简称高剂量组)、低剂量治疗组(低剂量组),每组12只动物,24只眼。

1.2造模方法 光照前充分暗适应24小时,大鼠按30mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射全麻,双眼爱尔凯因表麻,阿托品眼液充分散瞳,置于手术显微平台上,分别照射左右眼。光照强度为22000±1000lux(用ST-III型光度计测定),距角膜距离为150±3mm,垂直照射大鼠瞳孔,照射时间为30 分钟,光照过程中角膜完全暴露,间断角膜滴水湿润眼球表面;室温控制在21～24℃左右;全部照射完后再次暗适应24小时。

1.3给药方法 高剂量组:葛根素成人日用量20倍,兑生理盐水尾静脉注射(168mg/kg);低剂量组:葛根素成人日用量5倍,兑生理盐水尾静脉注射(42mg/kg);正常组:等容量生理盐水,尾静脉注射;模型对照组:给等容量生理盐水,尾静脉注射。每日1次,连续给药1周。

1.4观察指标及测试方法：给药1周后处死动物,速取右眼,进行视网膜光镜及免疫组化检查。

1.4.1HE染色 动物处死后摘除眼球,并在手术显微镜下去除角膜、晶体及玻璃体后,立即放入10%中性福尔马林溶液中固定48小时,经逐级酒精脱水,二甲苯透明、浸腊,石蜡包埋。经视乳头矢状面纵向做4～5μm厚的切片,HE染色;在Mias-2000图形分析系统下观察,记录200倍镜下视网膜外核层连续5个视野的面积和外核层细胞核的含量。

1.4.2Cyt-c、Caspase-3表达 首先将SP法染色切片在10×10低倍视野下进行全面观察,寻找视网膜内Cyt-c、Caspase-3阳性物质最丰富区域然后在10×20中倍视野下选择5个热点区,采用MIAS-2000型图像分析系统测量各个指标阳性物质的面积、平均光密度、积分光密度和平均黑度,表示它们的含量。镜下观察Cyt-c、Caspase-3阳性物质棕褐色至淡黄色,呈细丝状或者细颗粒状,主要表达部位在视网膜细胞胞浆内。

2 结果

2.1对大鼠视网膜形态学影响

(1)正常组 视网膜结构层次分明,光感受器细胞视杆内、外节排列整齐规则,分界清晰,内、外核层排列紧密,染色均匀,细胞形态规整。

(2)模型组 视网膜外核层变薄,细胞排列较正常组稀疏,出现较多染色不规则或破碎的细胞核。内外节排列紊乱,分界欠清,出现不规则淡染区。

(3)治疗组 高剂量组:同模型组相比,无明显改变,外核层变薄,细胞排列稀疏,内外节排列紊乱,分界不清。低剂量组:视网膜外核层较模型组增厚,细胞排列致密。

各组间视网膜外核层HE染色结果比较

△与正常组比较:P<0.05;*与模型组比较:P<0.05

上表提示:模型组、高剂量组的积分光密度、面积与正常组比较,均明显低于正常组,差异有统计学意义(P<0.05);低剂量组与模型组比较,面积、积分光密度增加,差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2葛根素注射液对大鼠视网膜Cyt-c表达的影响

正常组视网膜外核层细胞浆中Cyt-c阳性物质含量较少。模型组视网膜外核层细胞浆中Cyt-c阳性物质含量较多。用药各组视网膜外核层细胞浆中Cyt-c阳性物质有不同程度减少,检测结果见下表:

葛根素注射液对大鼠视网膜Cyt-c表达的影响比较

与正常组比较:△P<0.05;△△P<0.01与模型对照组比较:*P<0.05;**P<0.01

上表提示:模型对照组与治疗组的Cyt-c面积、积分光密度、平均黑度及平均光密度均高于正常组,差异有统计学意义(P<0.05);高剂量组与模型对照组比较差异无统计学意义(P>0.05);低剂量组与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)。提示低剂量组葛根素注射液具有使光损伤后大鼠视网膜Cyt-c含量降低的作用。

2.3葛根素注射液对大鼠视网膜Caspase-3表达的影响

正常组视网膜外核层细胞浆中Caspase-3阳性物质含量较少。模型组视网膜外核层细胞浆中Caspase-3阳性物质含量较多。用药各组视网膜外核层细胞浆中Caspase-3阳性物质有不同程度减少,检测结果见下表:

葛根素注射液对大鼠视网膜Caspase-3表达的影响的比较

与正常组比较:△P<0.05;△△P<0.01与模型组比较:*P<0.05;**P<0.01

上表提示:模型组与治疗组的Caspase-3蛋白酶表达的面积、积分光密度、平均黑度及平均光密度均明显高于正常组,差异有统计学意义(P<0.05);高剂量与模型组比较,差异无统计学意义(P>0.05);低剂量与模型组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。提示:低剂量组葛根素注射液 具有使光损伤后大鼠视网膜Caspase-3的表达降低的作用。

3 讨论

葛根素成品制剂主要有葛根素注射液,葛根黄酮片等。近年来国内学者对葛根素的药理作用和临床应用做了大量的研究:葛根素具有降压、扩张冠状动脉和脑血管抗血小板凝聚等作用,主要用于治疗冠心病、高血压病、糖尿病[5,6]等。同时,葛根素治疗眼科疾病的验案也屡有报道,主要用于治疗视网膜动脉阻塞、视网膜静脉阻塞、糖尿病视网膜病变以及青光眼[7]等。视网膜光损伤及视网膜变性疾病如视网膜色素变性都是一种退行性病变过程,表现为视网膜感光细胞的凋亡。有研究表明:葛根素对氧自由基有清除作用,可减轻氧化损伤,抑制细胞凋亡,并能预防性对抗过氧化氢引起的氧化性损伤[4,8]。

本实验结果显示①葛根素注射液可降低急性视网膜光损伤视细胞Cyt-c的表达水平,提示葛根素注射液对视细胞损伤的保护作用很可能通过抑制细胞表达Cyt-c而实现的,但具体机制还有待以后进一步研究。② 葛根素注射液低剂量组Caspase-3呈较明显下降趋势,与模型组比较有显著性差异,提示葛根素注射液可能通过降低凋亡因子Caspase-3的表达,最终达到有效拮抗光刺激诱发的光感受器细胞的凋亡。

综上所述,葛根素注射液可减轻视网膜光损伤。其机制主要为:通过调节视网膜细胞凋亡相关基因减少视网膜中Cyt-c、Caspase-3的表达,从而抑制视网膜细胞凋亡,起到了保护视网膜光感受器细胞的作用。

[1] Cruicks hanks KJ,Klein R,Kleim BE,etal.Sunlight and age related macular degeneration .Arch Ophthalmol,1993,111:514-518.

[2] Mchil M.Sterbeger P.Bustom,etal.operating microscope induced retinal:photosixity pathophysilogy clinical manifestation and prevention Sury Ophthalmol,1990,34,237-252.

[3] Shahinfar S,Edward D P,TsoMOM.Apathologic study of photoreceptor cell death in retinal photic injury.Curr Eye Res,1991,10(1):47-59.

[4] 吴艳,万华印.葛根素抗培养脑细胞阿霉素损伤作用[J].中国病理生理杂志,2003,19(10):1413-1415.

[5] 蒋定伍.葛根素治疗不稳定型心绞痛的临床观察[J].内蒙古中医药,2010,29(12).

[6] 廖凌云,陈云.葛根素注射液结合硫酸镁治疗妊娠高血压综合征80例临床观察[J].赣南医学院学报,2010,30(1).

[7] 马兰.葛根素注射液治疗视网膜中央动脉阻塞10例分析[J].中外健康文摘,2010,12(7).

[8] 朱庆磊,何爱霞等.葛根素对氧自由基的清除何抗氧化性损伤作用[J].解放军药学学报,2001,17(1):1-3.