SPR光谱信号的无基线质心法*

王晓萍，董联红，詹舒越

(浙江大学光电系现代光学仪器国家重点实验室，杭州310027)

表面等离子体共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)检测技术以其灵敏度高、所需试样少、样品无需标记、响应速度快、可实现实时监控等特点，被广泛应用于生物、食品、医疗、环境等领域［1－6］。从 BiacoreTM(Uppsala Sweden)公司发布商业SPR仪器以来，SPR传感器与检测仪器得到飞速发展。目前，SPR传感器和检测仪器的主要发展方向是高灵敏、高分辨率、高通量、多通道及小型化［7－10］。对于最常见的角度调制型SPR传感器和检测仪器，其SPR共振角的确定方法对提高仪器信噪比和分辨率等指标具有重要作用，因此研究快速有效的SPR共振角计算方法具有重要意义。

常用的SPR共振角计算方法有质心法、多项式拟合法、特定反射率法、一阶导数过零点法［11－12］等。其中，质心法由于运算简单、所需时间少，而得到广泛应用。目前对于质心法的研究主要集中于如何进一步抑制噪声、提高分辨率。Nenninger等［13］提出的固定宽度动态基线质心法，Thirstrup等［14］提出的基于面积的动态基线质心法，以及郦雅平等［15］提出的基于幅值的动态基线质心法，均能有效抑制光源光强波动引起的SPR共振角波动;Johansen等［16］提出的加权质心算法，可以提高分辨率。

本文提出了一种无基线质心法，该方法具有运算速度快、受光源波动影响小、信噪比高、分辨率高等特点。对具有明显光源光强波动的实验数据和宽折射率范围样品的实验数据，分别采用固定基线质心法、基于幅值的动态基线质心法以及本文提出的无基线质心法进行分析研究，结果表明无基线质心法运算简单、不受光源波动影响，且具有较高的信噪比和分辨率。

1 算法描述

SPR共振角通常用SPR反射光谱共振点对应的像素位置(共振像素)表示。质心法首先要选定一条基线，然后按式(1)可求得该基线和SPR光谱曲线所构图形的质心，并将质心对应的像素值作为共振像素。

式中i是像素值，i1和i2分别为基线与SPR光谱相交的第一像素点(起始像素)和第二像素点(终止像素)，Ri为像素i对应的光谱值。

1．1 固定基线质心法

固定基线质心法的基线一般取SPR曲线约2/3深度的位置，其参数为基线的高度，如图1所示，通常根据实验数据来确定。该方法简单，但光源波动引起的SPR光谱曲线的整体偏移会影响共振像素。如图2所示，假设SPR光谱1受光源波动影响，正向移动数值0．2到SPR光谱2位置，由于被测介质折射率没变，所以SPR光谱的形状不变。若采用固定基线1分别计算光谱1和光谱2的共振像素，由于两光谱与基线1所构图形的面积不同，得到的质心位置也不同，所以共振像素位置不同。由此可见，固定基线法易受光源波动的影响。

图1 固定基线质心法与无基线质心法示意图

图2 光源光强波动对固定基线、动态基线、无基线质心法的影响效果

1．2 动态基线质心法

动态基线质心法的基线随着SPR光谱的变化而变化，如图2所示。当光谱1因光强波动偏移到光谱2位置时，基线也动态变化到基线2位置。分别计算基线2与光谱2所构图形以及基线1与光谱1所构图形的质心，由于两图形面积基本相等，质心位置也基本相同，所以共振像素位置基本不变。由此可见，动态基线质心法对光源波动不敏感，但其计算过程比固定基线法稍为复杂。对于引言中介绍的三种动态基线质心法，基于幅值的动态基线法相比其它两种动态基线法，不仅受光源波动影响小，而且更加简单快速。所以本文采用基于幅值的动态基线法作为对比算法，该方法依据基线位于SPR曲线约2/3高度的原则，根据实验数据确定其算法参数—幅值比［15］。

1．3 无基线质心法

本文提出的无基线质心法，是通过计算如图1所示阴影部分的质心，来确定共振像素，其参数为起始像素和终止像素。根据这两个参数确定的左右边界与SPR光谱及像素坐标轴构成的图形，再利用式(2)［17］计算得到其质心和像素。

起始像素和终止像素根据实验数据确定，对于窄折射率范围样品实验，起始像素和终止像素对应的反射率要求在SPR曲线约2/3的高度位置;而对于宽折射率范围样品实验，由于共振像素变化范围较大，为准确获得宽折射率范围样品的SPR光谱共振像素，所选像素范围也应变宽。

讨论光源波动对该算法的影响，如图2所示，当光谱1变到光谱2时，左右垂直边界线与光谱2及像素坐标轴构成的图像只是在光谱1对应图形基础上增加一个矩形。当光源波动引起SPR光谱偏移时，矩形的宽度没有改变，两个矩形的质心对应的像素保持不变，整体共振像素位置基本不受影响。因此，该算法计算共振像素不受光源波动影响，可有效抑制噪声。

2 实验研究

2．1 材料与试剂

实验材料包括SpreetaTM传感器(128像素线阵CCD，Texas Instruments Inc．，USA)、HPLC 进样阀(C4 －1004 －．5，Valco Instruments Inc．，Switzerland)、HPLC 泵(UC－3281，北京优联光电科技公司)、工业注射泵(MSP1－C1，中国保定兰格公司)、十通选择阀(EMHMA-CE，Valco Instruments Inc．，Switzerland)和阿贝折射率仪(上海申光仪器公司)，样品为中国医药集团的氯化钠(NaCl，分析纯)和蔗糖(C12O22H11，分析纯)。

2．2 实验方法

双重蒸馏水作为溶剂配制NaCl标准溶液:浓度分别为 0．1 mg/mL、0．2 mg/mL、0．3 mg/mL、0．4 mg/mL、0．5 mg/mL、1 mg/mL;蔗糖标准溶液:浓度分别为 0．1%、0．2%、0．4%、0．6%、0．8%、1%、2%、4%、6%、8%、10%。同时双重蒸馏水也作为缓冲液。

由HPLC进样阀和HPLC泵构成NaCl溶液实验的SPR进样系统，由十通选择阀和工业注射泵构成蔗糖溶液实验的SPR进样系统，SpreetaTMSPR传感器输出的SPR光谱数据，由计算机采集处理。实验时，NaCl标准溶液和蔗糖标准溶液从低浓度到高浓度分别检测了4次和3次。

3 结果与分析

3．1 运算速度

对NaCl标准溶液的23 429组光谱数据，分别采用固定基线质心法、动态基线质心法和无基线质心法计算SPR共振像素，它们的平均运算时间分别为0．81 s和 0．83 s 和 0．70 s。对蔗糖标准溶液的108 259组光谱数据，也采用三种质心法计算，所需的平均运算时间分别为 3．50 s、3．55 s 和 3．20 s。结果表明，无基线质心法具有最快的运算速度。

3．2 NaCl溶液实验结果与分析

在低浓度NaCl溶液检测实验中，光源噪声表现明显。用三种质心法处理光谱数据时，也结合运用平方加权算法以减小结果的线性偏差［16］。根据三种质心法最佳参数的确定原则，得到固定基线质心法的基线值是0．85，幅值动态基线法基线高度比是0．35，无基线质心法的像素范围是65到97，运用三种质心法计算获得的SPR传感监控图(共振像素随时间的变化)如图3(a)～图3(c)。从图可见，固定基线法受光源波动等因素影响明显，另两种质心法受光源波动影响明显较小。

进一步分析它们的信噪比(SNR)，以每个浓度对应的四个检测峰的平均值作为信号，峰值之前蒸馏水缓冲液信号的标准偏差平均值作为噪声，三种算法的信噪比－样品浓度的线性拟合曲线如图3(d)所示。由图可见，无基线质心法具有较高的信噪比。

图3 NaCl溶液实验SPR监控图及分析结果

3．3 蔗糖溶液实验结果和性能指标

同样根据三种质心法最佳参数的确定原则，得到固定基线质心法的基线值是0．63，幅值动态基线法的基线高度比是0．33;由于蔗糖溶液浓度范围宽，使得SPR共振像素变化范围较大，因此无基线质心法的像素范围确定为27到112。

与NaCl实验分析方法相似，首先运用三种质心法计算获得SPR传感监控图如图4(a)～图4(c)，再根据监控图可得到三种方法信噪比的二阶多项式拟合曲线，如图4(d)所示。由图可见，无基线质心法具有较高的信噪比。

运用阿贝折射率仪分别测量浓度为0%、1%、2%、4%、6%、8%和10%的蔗糖标准溶液，得到它们的折射率为 1．332 0、1．333 5、1．335 0、1．337 9、1．340 6、1．343 4 和1．346 4。对这些数据进行线性拟合可得到浓度与折射率的校准方程RI=1．332 08+0.142 75×C，据此方程可计算出浓度为0．1%、0．2%、0．4%、0．6%和0．8%的蔗糖标准溶液的折射率分别为1．332 2、1．332 4、1．332 7、1．332 9 和1．333 2。

图4 蔗糖溶液实验SPR监控图及分析结果

根据各浓度蔗糖溶液的共振像素(P)和各浓度蔗糖溶液对应的折射率(R)，运用二阶多项式拟合得到共振像素—折射率校准(P－R)曲线如图5所示。实际样品测量时，根据SPR检测到的共振像素以及该P－R校准曲线，可以得到样品的折射率。

图5 三种算法对应的共振像素－折射率校准曲线

根据灵敏度(SRI)的定义dP/dR，以及P－R的二次校准方程(曲线)，灵敏度是一个与R有关的变量。在选取R=1．3320时，三种质心法的灵敏度分别为2 530．906，2 535．495 和1 577．654 Pixel/RIU。

折射率分辨率(σRI)的定义为，其中为噪声水平。以监控图峰值之前缓冲液信号的标准偏差的平均值作为噪声，三种质心法的噪声分别为0．001 072，0．000 887 和 0．000 484，结合上面得到的灵敏度SRI，可以得到三种质心法的分辨率分别为4．24，3．50，3．07×10－7RIU。结果表明无基线质心法的分辨率最高。

从蔗糖溶液实验可知，无基线质心法的灵敏度比其它两种方法小，信号响应值略低，但噪声抑制程度比其它两种方法大，所以信噪比和分辨率比其它两种方法略高一些。可见该算法在选取合理参数条件下，能有效抑制噪声水平，在提高运算速度的同时，信噪比和分辨率略优于其它两种方法，在窄折射率范围和宽折射率范围的检测实验中均可使用。

4 结论

提出并研究了一种SPR共振角的快速计算方法。对多种质量浓度的氯化钠和蔗糖溶液的SPR光谱数据，分别运用固定基线质心法、基于幅值的动态基线质心法和无基线质心法计算共振像素，得到三种方法的SPR监控曲线。分析结果表明，无基线质心法不仅对光源波动不敏感，而且在运算速度、信噪比、分辨率等方面都具有一定优势。在自行开发的SPR检测系统中加以应用，体现出该方法对提高SPR检测系统的性能指标具有重要作用。后续将在自行研制的多通道SPR传感器中，运用该方法进行数据处理和分析，进一步明确方法参数的确定原则。

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