HMGB1在肾透明细胞癌中的表达及其临床意义

张明星, 窦中岭, 史海军, 刘 辉, 王晓彬

肾细胞癌(renal cell carcinoma，RCC) 是泌尿生殖系统常见的恶性肿瘤之一，占泌尿系肿瘤的第二位，其患病率呈逐渐增高趋势。肾透明细胞癌(renal clear cell carcinoma,RCCC)是肾细胞癌中最常见的一种病理类型，占RCC的60%～80%，大多数发生于中老年人，死亡的主要原因是肿瘤的浸润和转移，且患者易在没有任何临床症状的情况下出现广泛转移，故严重威胁着我国中老年人的健康。因此探讨RCCC的浸润转移机制尤为重要，发现敏感性和特异性均理想的肿瘤标记物对此有着极为重要的意义。本研究通过检测高迁移率族蛋白B1(HMGB1)在RCCC中的表达情况及其与临床病理参数的相关性，阐述其在RCCC发生发展和浸润转移中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取河南科技大学第一附属医院泌尿外科2009年至2011年间经病理证实为RCCC的手术患者70例，其中男性46例，女性24例，年龄35～87岁，平均年龄60岁。常规术后甲醛固定石蜡包埋，全部标本HE染色后均经两位有经验的病理医师诊断。按2002年美国抗癌协会(AJCC)肾细胞癌TNM分期标准：Ⅰ期25例，Ⅱ期15例，Ⅲ期21例，Ⅳ期9例；组织学分级：高分化32例，中分化21例，低分化17例；有淋巴结转移15例，无淋巴结转移55例。同时，选取癌旁(距癌组织边缘3 cm)的正常肾组织40例；另收集同期在我院因外伤或肾结石行开放手术的20例正常肾组织。所有患者术前均未接受放疗、化疗和免疫治疗，全部标本HE染色后均经两位有经验的病理医师诊断。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化 所有标本均经4%甲醛固定，石蜡包埋，连续切片，厚度为4 μm，采用免疫组化二步法检测。一抗浓缩型兔抗人HMGB1多抗(稀释度为1∶100)和二抗生物素标记的兔抗小鼠IgG(工作浓度为1∶2 000)均购自武汉博士德生物工程有限公司。DAB显色，苏木素复染、脱水、透明、封片。每例标本切5张，每次染色时均用已知阳性切片作阳性对照，用PBS代替一抗作阴性对照。

1.2.2 结果判定 HMGB1表达位于细胞核，表现为浅黄、棕黄或棕褐色。用双盲半定量法评估其染色，无阳性细胞为(-)，阳性细胞数占肿瘤细胞数不超过25%为(+)，25%～50%为(++)，50%以上为(+++)。

1.3 统计学方法

所有数据均用SPSS11.5 统计软件处理，多组有序分类变量采用Kruskal-Wallis检验，各组之间两两比较采用Mann-Whitney检验，按不同临床病理指标进行分组，各组间的比较采用χ2检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 免疫组化

表1可见，HMGB1在正常肾组织、癌旁组织、RCCC中的阳性表达率呈现逐渐升高的趋势。依次为25.0%、37.5%、82.8%，RCCC组的表达较正常肾组织组、癌旁组织组明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)，而正常肾组织组与癌旁组织组之间的差异无统计学意义(P>0.05)，见表1，图1～3。

表1 HMGB1在正常肾组织、癌旁组织及RCCC组织中的表达

2.2 RCCC患者HMGB1表达与临床病理指标的关系

在70例RCCC中，HMGB1蛋白阳性表达率在临床分期Ⅲ期和Ⅳ期高于Ⅰ期和Ⅱ期，有淋巴结转移组高于无淋巴结转移组，肿瘤直径≥5 cm组高于肿瘤直径<5 cm组，肿瘤有坏死组高于无坏死组，差异均有统计学意义(P<0.05)，而与年龄、性别、分化程度、肿瘤所在部位均无关，差异无统计学意义(P>0.05),见表2。

表2 RCCC患者HMGB1表达与临床病理指标的关系

3 讨论

高迁移率族蛋白(high mobility group protein，HMG)是根据其在聚丙烯酰胺凝胶电泳中有很高的迁移率而得名，是与染色体结合的非组蛋白成分之一。HMGB1基因定位于染色体13q12，HMGB1蛋白含215个氨基酸残基，该蛋白在翻译后进行糖基化、酰基化、甲基化、磷酸化等修饰加工活动。根据结构特点，HMG超家族可分为HMGB、HMGN、HMGA三类。真核细胞染色质中含有丰富的HMGB1，且在进化过程中高度保守，其氨基酸序列同源性在大鼠和小鼠间达100%，在人和啮齿动物间高达99%。HMGB1分子包含2个“L”型HMG box结构域，HMG Box A和HMG Box B均包含80～90个氨基酸残基，中间有相似的重复氨基酸序列，呈较强的碱性，为DNA非特异性结合区，其酸性的C-末端包含超过30个连续的天冬氨酸和谷氨酸残基，借以完成和其他蛋白质之间交互作用及调节HBGB1与DNA结合[1]。HMGB1主要分布于细胞核内，参与多种基本的生物学过程如DNA复制、转录、重组及细胞的分化、成熟等。他与DNA结合，可稳定核小体形状，作为基因和组织特异性的转录调控因子有调节转录活性的作用[2]。尽管HMGB1蛋白结构缺乏缩氨酸先导肽，且不能穿出内质网和高尔基细胞器，但仍可释放到细胞浆，甚至细胞外。HMGB1具有多重“身份”[3]：一种抗凋亡蛋白；当他从细胞核内被动释放，则是一种创伤细胞死亡信号；活跃分泌的HMGB1是一种细胞因子，作为应激信号和炎症因子诱导细胞因子，激活炎症细胞；HMGB1在细胞外的其他信号角色，诸如可溶性分化因子等。研究表明，多种肿瘤细胞中均发现HMGB1蛋白表达，HMGB1与癌细胞的发生发展侵袭和转移密切相关[4]。Xin等[5]经免疫组化及Western blot分析显示，HMGB1在宫颈鳞癌组织中，尤其是发生转移的宫颈鳞癌组织中呈强阳性表达。Sharma等[6]通过分析发现，HMGB1的表达水平与肿瘤的发生阶段相关，肿瘤发生早期HMGB1表达率为20%，而晚期表达率为80%。Wu等[7]利用免疫组化分析鼻咽癌临床病理标本，HMGB1高表达率为53.6%，且HMGB1过表达与肿瘤临床T级、N级及远处转移显著相关。

针对HMGB1在肿瘤细胞中的过度表达，目前至少有两种解释：HMGB1的过度表达可以导致与肿瘤表型基因的反常表达，从而引起肿瘤；或者，在已经获得肿瘤表型基因的细胞中，只有那些存在HMGB1过度表达的细胞才能幸免于细胞凋亡，继续生长，引起肿瘤。另外一种可能是，过度表达HMGB1的细胞或者由于坏死(如因为缺氧)而被动释放，或者主动分泌，均可将HMGB1释放入细胞外介质中。细胞外HMGB1继而促进邻近肿瘤细胞或肿瘤支持血管增殖[8]。

本研究结果发现，HMGB1蛋白在肾透明细胞癌中的表达率为82.8%，在癌旁组织中的表达率为37.5%，在正常肾组织中表达率为25.0%，说明HMGB1表达可能与肾组织良恶性行为有关。肿瘤直径≥5 cm组较<5 cm组HMGB1阳性率明显增加，肿瘤有坏死组较肿瘤无坏死组HMGB1阳性率明显增加，说明HMGB1的表达可能抑制细胞凋亡，加速了肿瘤的生长，同时HMGB1促进肿瘤抗原的呈递和树突状细胞(DC)的成熟，从而激发保护性的抗肿瘤免疫反应，使肿瘤细胞坏死。可以推测HMGB1的表达在RCCC的发生发展中起着双重作用[9]。此外，RCCC中HMGB1高表达在有淋巴结转移组、高分期组中比例明显高于无淋巴结转移组和低分期组，提示HMGB1可能以某种机制参与RCCC的浸润、转移过程，这些表现与其在结、直肠肿瘤中的表现相似[10]。同时我们的研究发现，虽然HMGB1在低分化癌组织中的表达强于高、中分化癌组织，但差异无统计学意义，说明其与肿瘤的分化程度可能无明显关系。此外，HMGB1表达与年龄、性别、肿瘤部位无关。近来有研究发现HMGB1在肿瘤的侵袭期间起着关键作用，该蛋白涉及肿瘤转移的形成及肿瘤的生长[11]。肿瘤侵袭期间HMGB1通过与其配体晚期糖基化终产物受体结合，激活p38、SPA/JNK和p42/p44MAPK等信号通路，继而引起基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9激活，后两者是纤维蛋白溶酶激活级联的下游目标，能使细胞外基质降解促进肿瘤浸润、转移。通过阻断HMGBl信号传导通路能显著抑制肿瘤的生长、浸润及转移，并能抑制免疫缺陷鼠自发形成肿瘤。

作为HMGB1配体的RAGE的过表达也被发现与肿瘤相关，尤其是浸润性胃癌[12]。对于前列腺癌和结直肠癌患者来说，HMGB1和RAGE的联合表达预示肿瘤的转移倾向和较差的预后[13-14]。日本学者研究发现，HMGB1的配体RAGE在具高迁移能力的胰腺癌细胞株MIA PaCa-2和PANC- l中高表达，而在低迁移能力BxPC-3中几乎没有表达[15]。迄今为止，发现几乎所有的肿瘤细胞中都有HMGB1的表达上调，且其配体RAGE在不同的肿瘤细胞中也高表达，给予HMGB1或RAGE抑制剂，可明显抑制某些肿瘤细胞的增殖[16]。在肾透明细胞癌中可能也存在着这种机制，提示应用HMGB1选择性抑制剂是防治肾癌的可行性途径之一，可为临床治疗肾癌提供新的思路和方法。

总之，由于HMGB1被认为是一种普遍存在的染色质蛋白质，而且目前已证明在大多数肿瘤中过度表达，并与肿瘤的发生、浸润及转移密切相关，因此HMG1具有极大的潜力作为肿瘤预后标志物，或者肿瘤基因治疗的靶基因。本研究结果提示在RCCC中可以检测这个指标，将其作为临床工作中判断RCCC恶性程度和预后估计上的有效分子指标；HMGB1高表达提示患者预后不良，这对RCCC治疗方案的选择和预后评估有重要意义，但是还需要进一步的研究证实。

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