骨髓间充质干细胞移植对大鼠脑缺血再灌注损伤Livin和Caspase-3表达的影响

李文媛 王 莹 孙 平 贾 桦 佟晓杰

骨髓间充质干细胞移植对大鼠脑缺血再灌注损伤Livin和Caspase-3表达的影响

李文媛1＊王 莹1孙 平1贾 桦2佟晓杰2

（1牡丹江医学院解剖教研室，黑龙江157011；2中国医科大学解剖教研室，沈阳110001）

目的 探讨骨髓间充质干细胞（BMSCs）移植对大鼠脑缺血再灌注损伤海马区凋亡相关基因Livin和Caspase-3表达及神经元细胞凋亡的影响。方法 实验动物分为假手术组、模型组和BMSCs组，进行神经功能评分，应用TTC法检测脑梗死体积，追踪PKH26标记的移植BMSCs，应用免疫组化方法和 Western blot检测Livin、Caspase-3蛋白表达，应用TUNEL法检测细胞凋亡。结果 PKH26标记的BMSCs在海马区有表达。与模型组比较，BMSCs组神经功能评分显著降低（P＜0.05），脑梗死体积显著减少（P＜0.05）。BMSCs组与模型组相比Livin蛋白表达显著增高（P＜0.05），Caspase-3蛋白表达明显下降（P＜0.05），神经元细胞凋亡指数显著降低（P＜0.05）。结论 BMSCs对脑缺血再灌注损伤具有保护作用，其作用机制可能与上调Livin表达，下调Caspase-3表达，抑制细胞凋亡有关。

骨髓间充质干细胞；脑缺血再灌注；Livin；Caspase-3

脑缺血后恢复脑血流是治疗脑缺血最关键的方法，但再灌注后可加重缺血脑组织的损伤，这种损伤以凋亡为主，因此减少缺血／再灌注后神经元凋亡为重要的脑保护机制。Livin作为一种新发现的凋亡抑制蛋白（IAP）能够干预细胞凋亡线粒体通路，发挥抑制细胞凋亡的作用［1］。Caspase-3是凋亡过程中最关键的蛋白酶，是多种死亡受体介导的凋亡途径的共同下游效应部分［2］。为了探讨骨髓间充质干细胞（BMSCs）抑制脑缺血再灌注损伤神经元凋亡的机理，本实验观察了脑缺血再灌注损伤后BMSCs移植对海马区神经元细胞凋亡、Livin和Caspase-3蛋白表达的影响，为BMSCs移植治疗神经系统疾病的临床应用提供实验依据。

材料和方法

1.动物、药品及试剂

雄性SD大鼠42只，清洁级，体重280-320g，购于中国医科大学实验动物中心（许可证号：SYXK［辽］2003-0013），兔抗大鼠 Livin抗体、兔抗大鼠Caspase-3抗体、免疫组化SP试剂盒、DAB显色试剂盒、TUNEL试剂盒购于北京中山生物试剂公司，PKH26试剂盒购于sigma公司，抗β-actin抗体购于Santa Cruz公司。

2.BMSCs培养与鉴定

体质量100-120g健康雄性SD大鼠颈椎脱臼处死，无菌条件下取双侧胫骨和股骨，用DMEM培养液冲洗骨髓腔，收集骨髓冲洗液，平均分装在2个50ml培养瓶中，每瓶加至培养基5ml，放入37℃，5%CO2培养箱中培养；待贴壁细胞完全融合后，2.5g／L胰酶消化传代。当细胞传至第三代时接种到两个瘤孔板内，每孔细胞密度为1x105个／ml，达到80%共融时每个板分别加入成骨诱导剂，进行BMSCs向成骨诱导的细胞鉴定。成骨诱导剂为：含有10% 小牛血清的DMEM，0.1μmol／L的地塞米松，50μ的维生素C，10mmol／L的β-磷酸甘油钠；成脂肪诱导剂为：含有10% 小牛血清的DMEM，0.5mmol／L3-异丁 基-1-甲 基 黄 嘌 呤，1μmol／L 的 地 塞 米 松，10μmol／L的胰岛素，200μmol／L的吲哚美辛。

胰酶和／或EDTA消化BMSCs形成单细胞悬液。2×107细胞于锥形离心管中，用无血清培养基洗一次；离心5min；吸去上清，加1ml稀释液C，重悬细胞保证完全离散，别震荡。染色前，准备4×106mol／L的PKH26染液（用稀释液C稀释）置于离心管中。尽快加1ml 2×细胞到1ml 2×染料，立即用吸管均匀快速混合样品，25℃孵育的2-5min，定时轻轻颠倒离心管保证在25℃充分混匀。加入等量血清或1%BSA中止染色反应，孵育1min。用等量含血清培养基稀释中止的反应液。400g、25℃离心10min，去上清。细胞团转入新试管中，进一步洗三次。加10ml完全培养基，离心，重新悬置细胞。

4.模型制备及动物分组

参照Longa等［3］的线栓改良法制成大鼠右侧大脑中动脉缺血（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型，将大鼠采用随机数字表法分为：假手术组（n＝12）、模型组（n＝12）和BMSCs组（n＝12），模型组和BMSCs组分别于建模成功后3h经尾静脉注射等体积的PBS液和已制备好的BMSCs悬液，BMSCs组每只大鼠移植细胞数为4×106个／100μl。

5.神经功能评估

采用Chen等［4］报道的神经功能损害评分表（neurological severity scores，NSS），从运动、感觉、反射、平衡4方面进行神经功能损害评估，22分为最严重的神经功能损害，即评分越高神经功能损害越严重。缺血后7d各组大鼠分别进行NSS评分。

6.TTC法染色

取部分脑组织冠状面均匀切成2mm厚脑片，2%TTC染色，数码相机拍照，以图像处理软件（image Pro Plus 5.1，Olympus）测量梗死面积，计算梗死面积与损伤侧脑半球的面积比。

③开发商与农户结合的小农市场风险盛行阶段。开发商充分借助多种基层运作的方式获得了土地使用权，村集体没有实权，因此开发商能够不通过村集体而通过村代理人与农户开展村集体土地经营权交易活动，这一过程中存在着非常明显的市场风险与农业风险。若在这一过程中市场主体数量明显增多，则村庄发展过程中无法形成规范化的秩序，进而对村庄的健康发展产生了十分不利的影响。

7.免疫组织化学检测

缺血后7d，取脑组织行冰冻切片，在视交叉后1-4mm处冠状切面切开，在海马齿状平面连续冠状切片，片厚4μm。组织薄片以PBS漂洗2次，0.5%过氧化氢孵育10min；PBS漂洗3次，正常山羊血清37℃孵育15min后，滴加稀释后的一抗Livin（1：100）、Caspase-3（1：150），4℃过夜。滴加生物素标记体，30min，37℃。滴加过氧化物-链霉素卵白素37℃，30min。DAB显色液显色。苏木精复染，以PBS代替一抗作阴性对照。镜下观察并摄片。阳性率的定量分析：每个标本取4张切片，400倍光镜下每张切片在海马随机选5个视野，用计算机图像分析系统（HPIAS-1000）对各组阳性细胞进行OD值分析。

8.凋亡神经元的检测

缺血后7d，采用原位末端TUNEL标记法检测。将甲醛固定大鼠海马组织标本常规脱水，石蜡包埋，连续切片，厚4μm，脱蜡后按照In situApoptosis Detection Kit说明书操作；阴性对照采用pH7.2-7.6，0.01mol／L PBS代 替 TUNEL 反 应液。阳性率的定量分析：每个标本取4张切片，每张切片在海马随机选5个视野，400倍光镜下应用目镜阳性细胞所占的百分比。细胞凋亡指数（apoptosis index，AI）＝凋亡阳性细胞总数／细胞总数。

9.Western blot法

缺血后7d，检测Livin和Caspase-3表达提取蛋白后采用BCA定量试剂盒测定蛋白浓度。SDSPAGE凝胶电泳分离蛋白后转至硝酸纤维素膜；封闭缓冲液封闭后，加入一抗（anti-Livin 1：100稀释，anti-Caspase-3 1：120稀释）4℃孵育过夜，各自对应二抗（1∶2000稀释）孵育2h，TBS洗净后经显色液显示15min，扫描后经Image J图像分析软件对印迹区进行灰度分析。

10.统计学处理

所得数据以采用SPSS 13.0软件进行统计学分析，数据以均值±标准差（¯x±s）表示，采用不配对t检验及单因素方差分析处理数据，P＜0.05为差异有显著性。

结 果

1.BMSCs的分离、培养、鉴定

相差显微镜下观察，刚接种时为悬浮于培养液中的大小不等圆形细胞，48h后可见少数细胞贴壁，为成纤维细胞样细胞，圆形细胞附着在这成纤维细胞样细胞表面。以后贴壁成纤维细胞样细胞逐渐增多，圆形细胞经反复传代后消失，约在7-10d80%-90%长满培养瓶底，融合成单层，此时传代。传3代后的BMSCs形态更加均一，排列更加有序，呈漩涡状排列，3-4d左右即可长满培养瓶底，纯度达到95%以上（图1A），约7d左右贴壁率达80%-90%。应用成骨细胞诱导液配制培养基培养BMSCs，2-3d换一次培养液，28d后发现细胞胞浆出现钙盐沉积，茜素红染色后胞浆内呈红色聚集物（图1B）

图1 A：第3代，细胞呈漩涡样排列（×200）。B：体外诱导28d，细胞内的钙沉积茜素红染色（×400）。C：海马内PKH-26标记红色荧光BMSCs（×100）。Fig.1 A：BMSCs within 3passages were exhibited whirlpool morphology in the confluent culture（×200）；B：After differentiation 28d，the deposition of calcium was determined by Alizarin Red（×400）；C：Red PKH-26Labeled BMSCs were observed in hippocampus（×100）.

2.BMSCs移植对神经功能损害评分的影响

假手术组神经功能损害评分值为0，无神经功能损害。BMSCs组（11.92±1.69）神经功能损害评分低于模型组（14.82±1.52），差异有显著性（P＜0.05）。

3.BMSCs移植对脑梗死体积检测的影响

TTC染色检测缺血后大鼠脑梗死体积，假手术组脑梗死体积为0，模型组和BMSCs组在缺血后1d和3d脑梗死体积无显著差异（P＞0.05），缺血后7dBMSCs组脑梗死体积显著低于模型组，差异有显著性（P＜0.05）（图2）。

图2 TTC染色检测各组脑梗死体积比，＊与模型组比较P＜0.05，n＝6。Fig.2 Infarct volumes by TTC staining and expressed as percnetage infarct volume determined by comparison with the contralateral hemisphere，＊vs model group，P＜0.05，n＝6.

图3 A：海马区Livin阳性表达（×400）。B：海马区Caspase-3阳性表达（×400）。D：海马区凋亡细胞（×400）。Fig3Immunohistochemical stain of Livin（A）and caspase-3（B）in hippocampus（×400）.D：Nuclei of apoptotic cells in hippocampus（×400）.

4.PKH-26标记的BMSCs在脑组织中的分布

缺血后7d，冰冻切片免疫荧光追踪PKH-26标记的移植BMSCs，可见BMSCs组在海马区有红色荧光信号表达（图1C）。而假手术组、模型组没有发现红色荧光信号。

5.BMSCs移植对 Livin、Caspase-3及细胞凋亡的影响

Livin和Caspase-3阳性细胞胞质着色，呈棕黄色（图3A，B）。缺血后7d，假手术组未见Caspase-3蛋白表达，Livin蛋白有少量表达。模型组Livin蛋白表达与假手术组无差异（P＞0.05），但Caspase-3蛋白表达显著增加（P＜0.05）。与模型组比较，BMSCs组Caspase-3蛋白表达明显降低，Livin蛋白表达增高，差别具有统计学意义（P＜0.05）（表1）。假手术组脑组织未见神经元细胞凋亡。模型组和BMSCs组可见到海马区神经元细胞凋亡，凋亡细胞胞质呈棕褐色（图3C）。BMSCs组神经元细胞凋亡指数明显少于模型组，差别具有统计学意义（P＜0.05）（表1）。

表1 海马区Livin、Caspase-3蛋白平均光密度值及神经元细胞凋亡指数 （OD，¯x±s，n＝6）Table 1 Apoptosis index of neurocytes，average optical desity of Livin and Caspase-3in hippocampus （OD，¯x±s，n＝6）

6.Western blot的检测结果

缺血后7d，Western blot检测模型组和假手术组未见Livin蛋白表达（P＞0.05），模型组Caspase-3蛋白相对表达较假手术组显著增加（P＜0.05）。与模型组比较，BMSCs组Caspase-3蛋白相对表达明显下降，Livin蛋白相对表达显著增高（P＜0.05）（图4A，B）。

图4 A：Western blot检测各组Livin和Caspase-3蛋白表达。B：各组Livin和Caspase-3蛋白相对表达，＊与假手术组比较P＜0.05，＊＊与模型组比较P＜0.05；n＝6。Fig.4 （A）Western blot results of Livin and Caspase-3in groups.（B）Protein relative intensity of Livin and Caspase-3in groups，＊vs sham operation group P＜0.05，＊＊vs model group P＜0.05，n＝6.

讨 论

骨髓间充质干细胞作为成体干细胞的一种，具有多向分化、增殖迅速、长期存活和低免疫原性的特点，可用于神经损伤时组织工程化的种子细胞［5］。有研究表明BMSCs能局部和静脉注射移植治疗中枢神经系统损伤［6］。本实验用PKH26标记的BM-SCs静脉途径移植给脑缺血大鼠，可见海马区有大量存活的PKH-26标记的BMSCs，证实了静脉移植的BMSCs能够通过血脑屏障进入宿主脑内，迁移至海马区发挥作用。进一步研究发现在缺血后7d，BMSCs组神经功能恢复明显优于模型组，梗死体积也显著减少，说明BMSCs移植具有抑制细胞凋亡和神经保护的作用。

细胞凋亡线粒体通路在缺血性脑损伤的发生发展中起重要作用，其作用途径是指氧自由基、钙超载等凋亡刺激因素使线粒体通透性增加，线粒体跨膜电位下降，释放细胞色素C（CytoC），CytoC主要激活Caspase-9进而也激活下游的Caspase-3，诱导细胞凋亡［7］。Livin作为一个新的凋亡抑制蛋白能够作用于线粒体通路，可以直接与Caspase-9前体蛋白（proCaspase-9）和其激活形式结合从而抑制其活性，还可以直接结合并抑制Caspase-3的活性，阻断他们依次裂解激活，同时阻断了Caspase-3对pro-Caspase-9的反馈激活，抑制细胞的调亡［8-9］。所以Livin基因的主要作用是抑制细胞凋亡和延长细胞寿命，而Caspase-3基因作用却相反，起着加速细胞死亡的作用。本研究发现与模型组相比，BMSCs移植能明显上调Livin蛋白表达，下调Caspase-3蛋白表达，降低神经细胞凋亡指数。提示BMSCs可能通过增加Livin表达，抑制促细胞凋亡基因Caspase-3表达，从而减少脑缺血再灌注损伤神经元细胞凋亡的发生，改善脑缺血大鼠的神经功能。

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Effects of bone mesenchymal stem cell transplantation on expressions of Livin and caspase-9after cerebral Ischemia-reperfusion in rats

Li Wenyuan1，Wang Ying1，Sun Ping1，Jia Hua2，Tong Xiaojie2
（1Department of Anatomy，Mudanjiang Medical College，Mudanjiang157011；2Department of Anatomy，China Medical University，Shenyang110001，China）

Objective To investigate the effects of transplantation of bone mesenchymal stem cells on the apoptosis of neural cells and the expressions of Livin and Caspase-3in the hippocampal region after cerebral ischemia-reperfusion in rats.Methods Rats were randomly divided into the sham operation group，model group and BMSCs group.Neurological function score and TTC staining were investigated.The expressions of Livin and Caspase-3proteins were detected by using immunohistochemistry method and Western blot.The apoptosis of neural cells was detected by TUNEL.Results PKH-26labeled BMSCs were observed in the hippocampal region.Compared with that of the model group，the neurological scores and cerebral infarction volume of the BMSCs group were significantly decreased（P＜0.05），and the apoptotic index and the expression of Caspase-3protein were significantly decreased in the BMSCs group（P＜0.05），but the expression of Livin protein was significantly increased（P＜0.05）.Conclusion BMSC transplantation has protective effects on cerebral ischemia-reperfusion，which may be related to up-regulating Livin protein，down-regulating Caspase-3protein，and thus reducing apoptosis of neural cells.

Bone mesenchymal stem cell；Cerebral ischemia-reperfusion；Livin；Caspase-3

R322.3＋2

A

10.3870／zgzzhx.2011.06.003

2011-05-20

2011-09-10

黑龙江省普通高等学校青年学术骨干支持计划项目（1152G050），黑龙江省卫生厅科研项目（2010243）

李文媛，女（1980年），汉族，讲师，硕士。

＊通讯作者（To whom correspondence should be addressed）