汾河(太原市景区段)微囊藻的分子多样性及产毒能力*

王 捷，谢树莲，王中杰，徐 瑶，李仁辉＊＊

(1:山西大学生命科学学院，太原030006)

(2:中国科学院水生生物研究所，武汉430072)

汾河(太原市景区段)微囊藻的分子多样性及产毒能力*

王 捷1，2，谢树莲1，王中杰2，徐 瑶2，李仁辉2＊＊

(1:山西大学生命科学学院，太原030006)

(2:中国科学院水生生物研究所，武汉430072)

对太原市汾河景区采集到的微囊藻进行分离纯化，得到7株微囊藻藻株，运用ITS、PC-IGS和gyrB基因序列构建系统树来研究其分子多样性.结果表明，太原市汾河景区微囊藻具有一定的分子多样性.采用mcyA基因和ELISA检测两种方法，即全细胞PCR测定微囊藻毒素合成酶基因A(mcyA)，对这些藻株的微囊藻毒素进行测定，检测的7株微囊藻中有6株含有mcyA基因，ELISA检测微囊藻细胞干粉产毒量在0.003-0.043mg/g之间，属于产低毒藻种.本文是首次报道太原市汾河景区微囊藻产毒素，也为汾河水环境保护提出了更高的要求.

汾河景区;微囊藻;分子多样性;毒素

水体的富营养化和蓝藻水华已成为全球关注的重要环境问题［1］.研究表明蓝藻水华涵盖了许多种(属)，如微囊藻属(Microcystis)、鱼腥藻属(Anabaena)、浮丝藻属(Planktothrix)、束丝藻属(Aphanizomenon)、拟柱胞藻属(Cylindrospermopsis)等，其中以微囊藻水华最为常见［2］.

微囊藻水华的形成给淡水环境带来了极大的影响.一些种类的微囊藻能产生次生代谢物微囊藻毒素(microcystin，MC)，该毒素是富营养化水体中最主要的蓝藻毒素类型，直接威胁水中鱼类及其它生物的生存，引发中毒甚至死亡.饮用水源中的微囊藻毒素会对人类的肝脏造成损伤并会引起肝癌，影响人类的健康和生存［3］.我国是微囊藻水华较为严重的国家，尤其是南方地区长江流域的大中型浅水湖泊是主要的微囊藻水华发生地，因此对微囊藻的多样性和分类及微囊藻毒素等研究大多集中在南方地区水体.近年来，虞功亮等［4-5］对昆明滇池微囊藻种类的多样性以及我国的微囊藻新类别进行了报道，吴忠兴［6］分析了中国中北部和南部20株微囊藻的多样性，刘海林等［7］对江苏太湖和潮州汤溪水库微囊藻的分子多样性进行了研究.但是，目前关于我国北方地区的蓝藻水华研究非常少，有关黄河流域水体中水华蓝藻的报道更少，这样的研究现状和格局对于我国水华蓝藻多样性的认识具有一定的局限性.

太原市汾河景区，即汾河太原城区段治理美化工程，全长6km.它是集休闲、度假、观光旅游为一体的大型公园，也是太原市目前规模最大的公共绿地游乐场所［8］.近年来，由于大量工业废水和生活污水的排入，致使汾河水污染日趋严重，微囊藻的数量也呈上升趋势.本文从该景区汾河水体中分离得到了微囊藻，并在实验室纯化培养，通过分子生物学的方法来研究微囊藻的分子多样性，并对其微囊藻毒素进行了分子生物学和化学分析.

1 材料与方法

1.1 采样位点与藻株分离

样品采于2009年8月，采用25号浮游生物网在位于太原市景区段的汾河水体中采集多次，置于5ml离心管中.采用经典的毛细管法，即用巴斯德吸管制作的毛细管(Pasteur Micropipette)在解剖镜下挑取单个群体，使用无菌纯水清洗6-8次，最后放入含有2ml MA培养基［9］的24孔培养平板中培养，4-5周便可得到单克隆藻种，纯化后的藻种编号分别为:TY001、TY002、TY003、TY004、TY005、TY006、TY007.

1.2 形态观察

显微观察和拍照的设备为Olympus BX51型光学显微镜，外接500万像素的数码相机(QIMAGING Micropublish 5.0 RTV)，与台式计算机相连.用附带的图像分析软件(Image-proexpress 5.1)进行数码拍照和细胞直径测量，图像测量前，使用Olympus的10μm台测微尺校正检验，测量误差小于0.001μm.观察时取一滴水，置于载玻片上，盖上盖玻片，直接用于镜检和显微拍照.

1.3 PC-IGS、gyrB和ITS序列的PCR扩增

采用全细胞PCR对PC-IGS、gyrB和ITS(16S和23S rRNA基因的间隔区)序列进行扩增，PC-IGS基因的扩增引物包括正向引物PCβF(5'-GGCTGCTTGTTTACGCGACA-3')和反向引物PCαR(5'-CCAGTACCACCAG-CAACTAA-3')［10］.gyrB基因的扩增引物为正向引物gyrBF(5'-CGATGAGGCCGTAGCGGGTTACTG-3')和反向引物 gyrBR(5'-CTCTTTCGCTACAATCAGCCA-3')［11］.ITS基因的扩增引物为正向引物(5'-AAGGGAGACCTA-ATTCVGGT-3')和反向引物(5'-TTGCGGTCYTCTTTTTTGGC-3')［12］，均由上海英骏生物技术有限公司合成.用 DNA 进行 PCR 扩增，PCR 反应体系为 20μl，包含 200μM dNTPs，1.5mM MgCl2，10×buffer-PCR 缓冲液2μl，10mg/ml BSA 1μl，引物各 10pmol，1U TaqDNA聚合酶，微囊藻悬浮液(约3 ×105cells/ml)1μl，其余用双蒸水补足.20μl反应体系于 MJ Mini BioRad PCR 仪(BioRad，USA)上扩增，扩增条件为:94℃预变性3min;94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸50s，共35次循环，72℃延伸10min.扩增产物用PCR纯化试剂盒(Qiagen，Germany)进行纯化.

1.4 ITS、gyrB、PC-IGS 序列测定及分析

PCR测序由北京华大基因科技有限公司进行正、反向测序，将测序得到的序列整理拼接后，用Clustal X1.83软件对测得的基因序列和GenBank数据库中的微囊藻以及集胞藻(Synechocystis sp.PCC6803)的基因序列进行多序列对齐排列.运用分子进化遗传分析软件MEGA4.0中的Kimura2-parameter模型计算各序列间的距离和序列相似性等，采用邻接法(neighbor-joining method，NJ)构建NJ树，空位或缺失位点均当作配对删除(pairwise deletion)处理.构树方法用自举检验(bootstrap)估计系统树分支节点的置信度，自展数据集为1000，以集胞藻(Synechocystis sp.PCC6803)为外类群.

1.5 微囊藻细胞毒素测定

各取1μl微囊藻细胞于PCR管中，用mcyA(上游引物:5'-AAAATTAAAAGCCGTATC AAA-3'，下游引物:5'-AAAAGTGTTTTATTAGCGGCTCAT-3')［13］，引物全细胞PCR检测微囊藻毒素合成酶基因A，实验设阳性对照(M.aeruginosa 7806)和阴性对照(加无菌纯水)，PCR反应体系和条件同1.2所述.

微囊藻总毒素的测定用微囊藻毒素ELISA［14］检测试剂盒(中国科学院水生生物研究所)进行检测.

2 结果与分析

2.1 微囊藻形态特征

群体团块较大，自由漂浮.细胞球形，直径4.3-5.9μm，有气囊(gas vesicle).群体发育早期为球形或椭圆形，中实，为青绿色或黑绿色，随着生长群体不断增大，最终形成不规则形状，胶被破裂或穿孔，群体成为树枝状或似窗格的网状体.胶被不密贴细胞，距离2μm以上.胶被无色或微黄绿色，无折光，无分层，不明显.胶被内细胞排列较紧密.参照胡鸿钧和魏印心《中国淡水藻类——系统、分类及生态》［15］、虞功亮等［4］所描述铜绿微囊藻形态特征，可以确定7株微囊藻均为铜绿微囊藻.

2.2 蓝藻ITS基因的序列及多样性分析

用于ITS基因序列研究的蓝藻共计30株，其中包含29株微囊藻，另外还有1株外类群集胞藻(Synechocystis sp.PCC6803).7株铜绿微囊藻经Clustal X1.83软件排序和手工调整后，得到序列矩阵总长度为320bp.用MEGA 4.0分析发现变异位点数(V)为28，简约信息位点数(Pi)为14，变异位点和简约位点分别占总位点的8.75%和4.38%.不同样品的碱基含量差异不大，碱基A、T、C和G的平均含量分别为33.8%、18.5%、21.1%和26.6%.G+C 的含量为 47.7%，A+T 的含量为52.3%，G+C 的含量稍低于 A+T 的含量.基于ITS基因构建的NJ树显示，TY001和两株日本藻种M.aeruginosa B-35、M.aeruginosa NIES298为一个聚类，说明TY001和这两株日本藻种亲缘关系较近.TY003、TY004、TY005、TY006、TY007为一个聚类，TY002单独为一个聚类，未与来自中国北部和中部的四株铜绿微囊藻(M.aeruginosa CC1，M.aeruginosa XW01，M.aeruginosa CL1，M.aeruginosa CL3)聚为一类(图1).

2.3 蓝藻PC-IGS基因的序列及多样性分析

用于PC-IGS基因序列研究的蓝藻共计44株，其中包含43株微囊藻.7株铜绿微囊藻经Clustal X1.83软件排序和手工调整后，得到序列矩阵总长度为626bp.用MEGA4.0分析发现变异位点数为72，简约信息位点数为47，变异位点和简约位点分别占总位点的11.5%和7.5%.不同样品的含量差异不大，碱基A、T、C和G的平均含量分别为24.8%、24.2%、27.6%和23.4%.G+C的含量为51%，A+T的含量为49%，G+C的含量稍高于A+T的含量.基于PC-IGS基因构建的NJ树显示(图2)，用于本实验研究的7株铜绿微囊藻，有6株和GenBank数据库中的铜绿微囊藻和西班牙的三株水华微囊藻(M.flos-aquae UAM-FMF-1、M.flos-aquae UAM246 和 M.flos-aquae UAM-CMF-3)为一个聚类，它们是 TY001，TY003，TY004，TY005，TY006，TY007.这个聚类中的铜绿微囊藻有6株来自于中国的云南滇池FACHB940、中国武汉东湖、上海淀山湖、黑龙江五大连池药泉，其它中国藻株均来自于中部和南部地区，但是没有和这6株藻聚为一类.TY002和M.panniformis SPC702为一个聚类，分支支持率为62%，这表示它和巴西的这株微囊藻亲缘关系较近.

2.4 基于gyrB基因的序列及多样性分析

用于gyrB基因序列研究的蓝藻共计26株，其中，包含25株微囊藻，另外还有1株是外类群，即集胞藻(Synechocystis sp.PCC6803).调整后的序列长度为960bp，用MEGA4.0分析发现变异位点数为22，简约信息位点数为10，变异位点和简约位点分别占总位点的2.29%和1.04%.不同样品的含量差异不大，碱基A、T、C和G的平均含量分别为29.3%、22.7%、23.4%和24.6%.G+C的含量为48%，A+T的含量为52%，G+C的含量稍低于A+T的含量.基于gyrB基因构建的NJ树显示(图3)，本实验所用的7株铜绿微囊藻，TY002，TY003，TY004，TY005，TY006，TY007 和日本的 M.ichthyoblabe TAC125 聚为一类，说明这 6 株铜绿微囊藻和日本的这株鱼害微囊藻亲缘关系较近.TY001和三株日本藻种(克隆)M.aeruginosa clone:gy10380.icb、M.aeruginosa NIES-91和M.aeruginosa NIES-101聚在同一分支上，分支支持率为64%.

2.5 毒素检测

微囊藻毒素采用mcyA基因和ELISA检测两种方法进行测定，mcyA基因PCR结果发现，除TY002外，其他6株微囊藻均扩增出290bp的目标条带(图4).

ELISA检测实验室培养的铜绿微囊藻毒素浓度，结果显示，TY001，TY003，TY004，TY005和TY007产低浓度的毒素，毒素浓度分别为 0.043、0.003、0.004、0.018 和 0.008mg/g，TY006 虽含有产毒基因 mcyA，但是未检测出毒素.利用测序得到的TY001，TY003，TY004，TY005，TY006和TY007mcyA基因核苷酸序列推导出氨基酸序列，并和GenBank下载的有毒微囊藻M.aeruginosa 7806(GenBank登陆号AM778952)氨基酸序列进行比对，结果显示，TY006相当于M.aeruginosa 7806的两个氨基酸Leu-1608和Gln-1609分别变化为Tyr和Lys，即L、Q变为Y和K.

3 讨论

3.1 微囊藻分子多样性讨论

到目前为止，在全球范围内已经报道了50多种微囊藻，但是微囊藻的分类还是比较混乱.造成这些混乱的原因主要有:1)室内培养和野外群体微囊藻种区别较大，同一微囊藻种有很高的生态表型多样性，不同的微囊藻有时会出现相同的生态表型和过渡类型.2)应用生理生化、分子生物学等方法显示，微囊藻属种类的基因型相似性较高［4］.传统的分类学方法即通过显微镜观察细胞的形状、大小、细胞排列和胶鞘等特征来对微囊藻进行分类，但是细胞形态会随着生理生态等因素的影响而发生变化，出现复合型或过渡类型，如果仅依靠形态特征分类，会出现一些偏差.因此，通过形态、生理生化、分子生物学等综合方法对不同生境的微囊藻属种类进行系统研究，揭示微囊藻属的系统分类和多样性变得非常重要［4，11，13］.目前为止，我国对于微囊藻分子多样性的研究还很少，尤其是中国北部地区.本研究从我国北方的黄河流域汾河中分离出了7株铜绿微囊藻，这也是首次得到黄河流域微囊藻藻种并对其多样性进行研究.一些研究者曾使用16S rRNA基因进行分类和分子多样性的研究，但是最近的研究发现，此基因比较保守而不宜作为种及种以下分类水平的分类［16］.为了探明这些形态种的分子多样性，本文选用突变频率较高、含有丰富遗传信息的三个基因(ITS、PC-IGS、gyrB)作为研究的目标基因.近年来，国内外许多研究利用ITS序列的差异来探讨微囊藻种群之间的基因型以及种群之间的动态变化和演替［17-18］.陈月琴等［19］报道不同微囊藻种间ITS序列相似性为94.8%，Otsuka等［20］报道的ITS序列相似性为93.3%-100%，铜绿微囊藻种内序列相似性为95.9%.Wu等［16］报道的微囊藻种间PC-IGS序列相似性为94.0%-99.8%.刘海林等［7］报道微囊藻 gyrB基因(974bp)种间序列相似性≥96.7%，铜绿微囊藻种内序列相似性为98.5%.本研究中，7株铜绿微囊藻ITS基因(320bp)序列相似性为97%-100%，PC-IGS基因(626bp)序列相似性为94%-100%，gyrB基因(960bp)种内序列相似性为97%-100%.比较这三个基因，我们可以判定PC-IGS序列的变异度要大于ITS和gyrB.基于ITS、PC-IGS基因构建的NJ树显示，山西汾河铜绿微囊藻具有一定的分子多样性，并且汾河的铜绿微囊藻与我国北部其它地区和中南部地区的铜绿微囊藻基因型存在差异.吴忠兴［6］通过对我国部分地区的微囊藻进行研究，表明中国中北部和南部地区的微囊藻有不同的基因型，这和本文结论一致.综合以上结果表明，中国不同地区分布的微囊藻具有较高的基因多样性.使用这三个基因构建的NJ树显示的结果不相同，说明同一地域表型相同的微囊藻，基因型可能不同，但基因型的聚类和表型没有直接关系.

3.2 微囊藻产毒素分析

淡水水华中发现的最常见蓝藻毒素是微囊藻毒素，它是一类具有强烈促癌作用的肝毒素，主要来自于微囊藻、浮丝藻和鱼腥藻等浮游性蓝藻［21-22］.本研究在汾河中首次发现产毒微囊藻，分离纯化得到的7株铜绿微囊藻藻株中有5株为产毒微囊藻，但是其产毒素量较低，这远远低于一般微囊藻干粉产毒量0.30-2.00mg/g［23］.有研究表明，环境因子对微囊藻毒素产生有很大的影响，这些环境因子主要包括光照、温度、pH值、氮元素、磷元素、溶解氧等，Watanabe等［24］发现，当光强增加时，M.aeruginosa M-228株的毒性逐渐增加，达到一定的强度后，毒性保持稳定.Wicks等［25］研究南非Hartbeespoort水库中的微囊藻毒素与环境因子的关系时发现，毒素浓度与太阳辐射呈正相关.何振荣等［26］在研究M.aeruginosa M 8641时，让它在温度分别为31℃、25℃和20℃条件下生长，发现25℃时毒性最低，细胞增长最快，低温有利于毒素的产生.连民等［27］研究不同浓度的氮、磷、锌、铁对HGZ培养基中的M.aeruginosa NIES-90产毒藻株的生长和产毒的影响时发现，藻毒素含量与氮、磷、锌、铁浓度呈正相关.本研究发现，TY006藻株含有mcyA基因，但是未检测出毒素.为了验证TY006藻株mcyA基因测序结果的准确性，分别由北京华大基因科技有限公司和上海美吉生物医药科技有限公司测序三次，得到的结果是相同的.基因比对结果显示，以已经报道的有毒微囊藻M.aeruginosa 7806的mcyA基因为参照，藻种TY006具有连续两个氨基酸的置换变化.Bozarth等［28］发现在加利福尼亚州Copco水库中的微囊藻mcyA氨基酸Lys-1610和Ser-1611中间插入了两个氨基酸Thr和Phe，本研究中铜绿微囊藻TY006中mcyA氨基酸并没有像Bozarth发现的插入氨基酸，而是出现连续两个氨基酸的置换变化，这是本研究中首次发现的.当然，是否由于这种变化造成铜绿微囊藻TY006的微囊藻毒素未被检出还有待于进一步研究.Mikalsen等［29］也发现一些微囊藻藻株含有mcy基因，但是不产微囊藻毒素.Kaebernick等［30］推测，这可能是由于微囊藻在生长过程中，mcy基因簇突变.Kurmayer等［31］对Planktothix rubescens产毒基因和产毒能力进行研究发现，P.rubescens的产毒基因与产毒能力并不一致.

致谢:感谢中国科学院水生生物研究所有害藻类学科组老师和同学们在实验中给予的宝贵意见和建议，保证实验顺利完成.在此向他们致以我最真挚的谢意.

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Molecular diversity and microcystin production of Microcystis in Fenhe River of Taiyuan

WANG Jie1，2，XIE Shulian1，WANG Zhongjie2，XU Yao2＆ LI Renhui2
(1:School of Life Science，Shanxi University ，Taiyuan 030006，P.R.China)
(2:Institute of Hydrobiology，Chinese Academy of Sciences，Wuhan 430072，P.R.China)

To study the molecular diversity of Microcystis in Fenhe River of Taiyuan，phylogenetic analyses based on ITS、PC-IGS and gyrB genes were performed from 7 isolated strains of Microcystis.These seven Microcystis strains formed distinct lineages，suggesting high diversity of Microcystis.ELISA and whole-cell PCR targeting microcystin synthetase gene(mcyA)were used to determine microcystin production.Results showed that six of the seven strains contain mcyA gene and the microcystin concentrations of the six Microcystis strains ranged from 0.003mg/g to 0.043mg/g.This is the first report of toxic Microcystis in Fenhe River，and it is urgent that more critical measures should be taken for the protection of Fenhe River.

Fenhe River;Microcystis;molecular diversity;microcystin

＊ 中国科学院“百人计划”项目(082303-1-501)资助.2010-10-19收稿;2011-01-10收修改稿.王捷，男，1984年生，硕士研究生;E-mail:wangjie901@126.com.

＊＊ 通讯作者;E-mail:reli@ihb.ac.cn.