肝癌干细胞的研究进展

高 杨(综述)，李 立，冉江华(审校)

(昆明市第一人民医院肝胆胰一科，昆明650011)

原发性肝癌是我国和某些亚洲地区常见的恶性肿瘤之一，其病死率在消化系统恶性肿瘤中居第三位，仅次于胃癌和食管癌。治疗肝癌的传统方法是通过手术切除、化疗、放疗等方法尽量去除已经存在的肿瘤细胞。然而，在这些常规治疗之后，肝癌的复发和转移仍然是难以避免的问题，即便是进行肝移植术移除整个病肝，这些问题还是难以得到控制，因此如何避免肝癌的复发与转移仍然是现今需要面对的严峻考验。近年来“干细胞”理论在肿瘤的研究方面引起了一些学者的关注，并且在多种恶性肿瘤中分离出了肿瘤干细胞(cancer stem cells，CSCs)，使CSC的理论逐渐形成。因此，人们也开始将肝癌的研究方向转向了肝癌干细胞，随之其它成为研究的热点。

1 CSC的理论起源

传统观点认为肿瘤的发生是由于正常成熟细胞在生长发育过程中某些特殊结构的消失，DNA发生突变，使正常细胞的生长、繁殖及凋亡发生失控，幼稚细胞大量增生，从而发生肿瘤。1983年，Mackillop等［1］提出了一种新的理论“肿瘤干细胞(CSC)”假说，认为在肿瘤中可能存在一部分具有类似干细胞功能特性的细胞，这一部分具有特殊功能的细胞能够发育成肿瘤，并维持肿瘤的生物学特性。1997年Bonnet等［2］在血液系统的恶性肿瘤中发现并分离了此类细胞，证实了CSCs的存在。近年来，在许多实体肿瘤中(如乳腺癌、前列腺癌、结肠癌等)发现有CSCs的存在。2008 年，Yang等［3］在肝癌组织中发现一种具有干细胞标志物CD90的细胞，此类细胞可以发育成肿瘤。在研究中几乎所有肝癌组织标本和约91.6%的血液样本中都含有表面标志为 CD45－CD90+的细胞，将这些细胞种植于免疫缺陷小鼠的皮下可以生成肝癌结节，证明了肝癌中同样存在CSCs。CSCs具有普通干细胞或祖细胞一样旺盛的繁殖能力和自我更新能力，正常干细胞的增殖分化受到自体基因的调控和许多外在因素的影响，处于一种动态平衡状态。然而，CSCs分裂与分化不受这些因素的调控，不断自我更新与分化繁殖，生产出大量不受抑制的肿瘤细胞，维持着肿瘤的生长与特异性［4］。

2 肝癌干细胞引起肝癌的发生

目前许多研究已经表明肝细胞肝癌中存在大量的干细胞。1999年，Wu等［5］研究发现，28%～50%的肝细胞肝癌中具有干细胞的免疫表型标志(如CK7、CK19等)。当肝癌细胞高表达干细胞表面标志物时，肿瘤切除或是肝移植都将有较高的肿瘤复发转移率。组织学和免疫学的研究也都表明，肝癌的发生是由于某种干细胞发育而来。Roskams［6］的研究显示，约有55%的癌前肝脏不典型增生或是癌前病变都含有大量的干细胞。Chiba等［7］从人类肝细胞肝癌Huh7和PLC/PRF/5两系中提取到了同时具有肝细胞和胆管细胞系特点的侧群细胞，将这些细胞种植到重症联合免疫缺陷鼠的体内能够成瘤，并具有高度侵蚀转移性，但在Hep2和Huh6这两个肝癌细胞系中未检测到侧群细胞。近年来多项研究表明侧群细胞具有CSCs的特性。

3 侧群细胞和肝癌干细胞

1996 年，Goodell等［8］利用烟酸己可碱 33342 荧光染色检测小鼠骨髓造血干细胞时发现，有些细胞核不着色或着色程度很低，表示极少数的细胞能将此荧光染料排出，且这群细胞在流式二维分析点阵图上呈彗星状分布在细胞主群的一侧，因此将这群细胞称为侧群细胞。在正常组织中，侧群细胞表达的基因与干细胞相似，都具有多向分化的潜能。因此，侧群细胞被认为具有与干细胞相似的特性。人们开始对侧群细胞表现出极大的兴趣，随着研究的深入，研究者发现侧群细胞能将烟酸己可碱33342染料排出，这可能与细胞膜上的一种三磷酸腺苷结合蛋白［ATP-binding cassette superfamily G(White)member 2，ABCG2］运载体有关。Zhou 等［9］发现侧群细胞表型的形成与ABCG2有着最直接的联系，侧群细胞高表达ABCG2有利于排除毒素。侧群细胞还具有自我更新和多向分化潜能，同样在一些肿瘤细胞系中，侧群细胞具有较高的自我更新和无限增殖的能力。Szotek等［10］从鼠卵巢癌细胞系MOVCAR7和4306中分离出侧群细胞，这些侧群细胞体外培养能产生侧群细胞和非侧群细胞，与正常组织相比侧群细胞比例明显高于非侧群细胞。Chiba等［7］进行的实验中也几乎得到同样的结果。侧群细胞不仅有发展成肿瘤的潜在能力，还能通过外排机制抵抗化疗药物，这些细胞可能在维持肿瘤的生长和复发中起着重要的作用。Shi等［11］研究表明肝癌标本中存在侧群细胞，其比例与肝癌术后早期转移复发率密切相关。因此，侧群细胞虽不等同于肝癌干细胞，但侧群细胞至少包含了部分肝癌干细胞。

4 肝癌干细胞的标志物

人们研究肝癌干细胞的生物学特性首先需要将其分离鉴定出来。在这过程中学者们尝试使用了多种表面标志物。目前，侧群细胞也作为鉴定肝癌干细胞的方法之一，但它并不十分理想。其原因是:①不是所有的肝癌细胞系中都能分离出侧群细胞;②烟酸己可碱33342具有DNA毒性，利用烟酸己可碱33342分选后的细胞难以辨别生物学特性是否发生改变。由于烟酸己可碱33342的排出与ABCG2有关，因此，ABCG2可替代侧群细胞分选法作为肝癌干细胞标志。

同时，学者们开始利用各种细胞表面单克隆抗原标志物对肝癌干细胞进行鉴定分离。在肝脏的发生过程中，CD90表达于肝脏干细胞或祖细胞表面，而在成人的肝脏中表达却十分稀少。目前，CD90已被认为是一种肝癌干细胞的表面标志物，这一观点在肝癌种植于联合免疫缺陷鼠的实验中得到证实。Yang 等［12］证实细胞也是一种敏感而特异的CSCs，可用于肝癌的早期诊断，并可用于肝癌的靶向治疗。Ma等［13］证实CD133作为一种跨膜糖蛋白，也是一种极有价值的表面标志物，表达于1%～5%的人肝细胞肝癌，而在正常肝组织中没有表达，并且和其他的肝癌细胞以及正常肝细胞相比，的细胞具有较大的形态。

除了这些单克隆抗原外，许多学者已经开始研究CSCs的生物学特征和肿瘤发生过程中的信号通路，以此作为鉴定分离肝癌干细胞的方法。Ma等［14］通过研究发现在的肝癌细胞中蛋白激酶B和B细胞淋巴瘤/白血病2两个信号通路被激活可能提高肝癌的耐药性，如果两种信号通路被阻断就可以提高肝癌对化疗的敏感性。Yamashita等［15-17］发现，上皮细胞黏附分子阳性的细胞与肝癌干细胞的大多数特性相同，而上皮细胞黏附分子基因的表达是通过Wnt/β连环蛋白通路来实现的。因此，如果阻断Wnt/β连环蛋白通路，肝癌的发生、发展就有可能受到抑制。Yang等［18］从肝癌中分离出具有肝脏干细胞表面标志物OV6+，发现这些细胞具有很强的成瘤能力，同时对化疗也十分不敏感。Tang等［19］研究发现，人类肝脏干细胞中转化生长因子β单次跨膜蛋白激酶受体Ⅱ和胚胎肝脏胞衬蛋白参与组成转化生长因子β信号途径，说明了转化生长因子β信号的构成成分与肝癌的发生、发展有关。转化生长因子β信号通路被阻断或白细胞介素6信号通路活化可能引发肝癌的形成。

虽然目前学者们通过研究已发现很多能够鉴定分离肝癌干细胞的标志物，但仍没有一种标志物能够单一地被利用来准确鉴别所有肝癌干细胞。

5 肝癌干细胞的应用

5.1 肝癌干细胞对放化疗不敏感的原因 由于传统的治疗方法很难避免肝癌的复发转移，故人们开始将目光转向了肝癌的起始细胞“肝癌干细胞”。由于它们对放疗化疗都不敏感，用传统的方法很难杀灭这些CSCs。其原因是:①CSCs可使晚期的肿瘤增加B细胞淋巴瘤/白血病2蛋白家族的水平和三磷酸腺苷结合盒转运的活性，所以肝癌极易复发，同时对化疗十分不敏感［20］。②CSC的基因具有不稳定性，Woodward等［21］通过对神经胶质瘤干细胞的研究发现Wnt/β连环蛋白可使细胞的基因极不稳定，对放射性治疗发生抵抗。③肿瘤对放射性治疗的抵抗，Clement等［22］研究发现在 CSCs自我更新和发育成肿瘤过程中，由于Notch和Hedgehog-Gli1信号途径的参与，使得肿瘤对放射性治疗发生抵抗。

5.2 肝癌干细胞的治疗策略 目前，针对CSC的新治疗措施主要有诱导CSCs分化成非肿瘤细胞或者抑制这些细胞的自我更新［23］，靶向针对CSCs使之对放化疗敏感和抑制血管增生等［20］。许多信号途径参与了正常干细胞的消亡和自我更新减低，同时促进了CSCs的增殖。例如，Hedgehog信号途径就决定了神经祖细胞的死亡和自我更新［23］。Berman 等［24］发现在胰腺癌中常常发生Hedgehog信号途径紊乱，而应用一种小分子Hedgehog信号途径阻断剂“环杷明”减低乙醛脱氢酶(一种CSCs标志)可以达到治疗胰腺癌的目的。Cheng等［25］利用某种特殊的γ分泌酶抑制剂抑制了Notch途径，发现CSCs的自我更新受到抑制，同时肿瘤的生长也随之减慢。许多学者发现利用小干扰RNA或者其抗体，可以抑制β连环蛋白活化T细胞因子基因及转录辅激活蛋白的能力达到阻滞Wnt途径的目的，使肿瘤的生长受到抑制，学者们还发现使用维生素D也能达到同样的效果［26，27］。Tang 等［19］对肝细胞肝癌的研究显示，与正常细胞相比，肝癌干细胞丢失了表达转化生长因子β单次跨膜蛋白激酶受体Ⅱ和胚胎肝脏胞衬蛋白的基因，肝癌的发生与转化生长因子β途径受抑制或白细胞介素6的活化有关。因此，白细胞介素6很可能是治疗肝癌的重要靶点。Wallner等［28］利用去睾丸小鼠研究前列腺癌时发现白细胞介素6信号途径被抑制可以阻碍CSCs的自我更新，同样的现象在肝癌中也得到证实。Miletti-González等［29］研究发现 CD44在肿瘤和非肿瘤细胞上的表达是不同的，因此，认为未来对肝癌的治疗可利用特殊抗体抑制具有特殊表面标志的靶细胞。利用全反式维甲酸可以将CSCs细胞诱导分化成低侵蚀性且分化程度较高的细胞，该方法已经在治疗急性早幼粒性白血病中得到应用，并取得很好效果。然而，CSCs对维甲酸等分化诱导剂的效果具有不确定性，也有可能导致不良的诱导效果。如利用维甲酸治疗某些乳腺癌时乳腺癌干细胞反而会分化成具有肿瘤基因表型的血管［30］。利用分化诱导疗法将肝癌干细胞向正常细胞方向诱导将是一种非常有前景的方法，但这一方法的实际应用还有待于鉴定肝癌干细胞的方法和分化诱导技术的进一步提高。

改变CSCs生长的微环境也是一项有效的治疗手段。Adams等［31］认为CSCs只有在特定的生长环境中才能不断自我更新，发育成肿瘤。利用甲状旁腺激素在实验室中改变CSCs的微环境可以改变CSCs 的发展方向［32］。Martínez-Iglesias 等［33］发现人类胚胎干细胞来源的成纤维细胞样细胞通过分泌胰岛素样生长因子2来支持CSCs生长的微环境。因此，通过靶向作用于胰岛素样生长因子2可以改变CSCs生长的微环境，从而达到治疗的目的。然而，这种治疗措施是否对肝癌有效还需进一步的研究。

6 展望

CSCs已经成为目前肿瘤研究的热点，为肿瘤的治疗提供了新的思路。肝癌干细胞的发现是在肝癌研究方面的一个重大突破，为临床诊断和治疗肝癌提供了新的线索。肝癌的发生、发展与肝癌干细胞的自我更新特性和分化能力密切相关。进一步了解肝癌干细胞的特性、发展规律、鉴定方法及生长环境的特殊性有助于发现针对肝癌干细胞诊断筛查方法以及特效的治疗手段。

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