血管环模型的研究进展

李秋影(综述)，李欣欣，周王谊，莫红梅，郭治昕※(审校)

(1.天津中医药大学，天津300193;2.天津天士力研究院药理毒理所，天津300410)

血管环研究起始于1980年，Robert F.Furchgott教授把血管条改成血管环模型，发现内皮细胞可释放一种使血管舒张的因子，即一氧化氮(nitric oxide，NO)。他因而获得了1998年度诺贝尔医学奖。从此，离体血管环实验在世界范围内得到了广泛的应用，用于基础研究、新药研发等领域。根据文献的调研，目前国内开展血管环实验研究的主要单位有以下7个:中南大学药学院(发表文献300篇)、北京大学医学部(发表文献247篇)、北京医科大学病理生理教研室(发表文献220篇)、中山大学医学院药理学研究室(发表文献169篇)、同济医科大学药理学教研室(发表文献157篇)、中国药科大学(发表文献73篇)及第四军医大学唐都医院(发表文献62篇)。

1 血管环的研究背景

血管环研究起始于研究血管释放物质，发展30余年至今已发生了巨大的变化。在发展的过程中，很多变量和新的实验方法被发明，并引入到后续研究之中。现已发展成为含有去内皮、无钙、无氧等多种模型的一系列实验平台。血管环也从主动脉血管环扩展到肺动脉血管环、基底动脉环、肾动脉血管环等。随着体外培养技术的发展，血管环还被用于观察血管生成、肿瘤发生、迁移、浸润机制等相关研究，并为开发抗肿瘤药物提供了一个新的平台。

血管环实验的检测指标，亦不再局限于血管的张力研究。在检测方法上，生理记录仪、比色法、酶联免疫法、成像技术等均已广泛应用在其中。

2 血管环的研究内容

血管环的研究分为两大类:第一类为血管收缩活性研究，主要应用在心脑血管病变的探索上，检测指标有血管张力，以及钙离子、内皮素、NO、前列腺素E合成酶等调节因子;第二类为血管生成活性的研究，主要应用于抗肿瘤研究和伤口愈合及器官移植等方面，检测指标有新毛细血管的生成数量，以及相关的调节因子的水平等。

2.1 血管收缩活性研究 各部位血管通过舒缩活动调节相应组织器官血流灌注，保证各组织器官正常的生理功能。当血管的舒缩活性出现异常时，机体也会发生相应的病理改变。因此，利用离体血管环来研究因血管活性异常而产生的各种疾病是一种不可多得的好方法。目前，胸主动脉环、脑基底动脉环在心脑血管药物的作用机制研究中有着广泛的应用。此外，血管内皮细胞在血管舒张中发挥着重要的作用，内皮细胞释放NO及前列环素可引起血管舒张，对调节心血管系统稳态起重要作用，因此血管环也用于血管内皮细胞完整性的评价。

2.1.1 高血压研究 很多研究者将调节血压的重任落到血管的舒张上，因此肾性高血压、自发性高血压、肺动脉高压等疾病的作用机制以及相关的新药开发领域，均充分利用血管环模型进行研究。

肾动脉张力是调节血管外周阻力的重要因素，肾血管阻力增高是高血压病时肾血流动力学改变的重要特征。肾动脉的病变导致管腔的狭窄进而肾脏缺血刺激肾脏皮质内球旁装置细胞分泌肾素过度，引发肾素血管紧张素系统过度激活，全身小动脉收缩血压升高，导致肾血管性高血压。可见肾动脉的张力在高血压病和肾血管性高血压的发病过程中起重要作用。离体肾动脉血管环为该领域提供了很好的工具。庄红等［1］采用两肾一夹高血压大鼠模型，在造模8周后，取大鼠的离体主动脉，制成动脉环，观察小分子活性肽Apelin对其的舒张作用。结果表明，Apelin-13具有显著的舒张主动脉的作用，并且对高血压大鼠血管环的舒张作用更强，提示Apelin-13在血管的保护作用中扮演着重要角色。

肺动脉高压是慢性阻塞性肺疾病的病理生理关键环节。诸多致病因素参与了肺动脉高压的发生与发展并最终引起血管收缩，导致血管重塑。肺动脉血管环已被广泛地应用于抗肺动脉高压药物活性地评价。李倩等［2］通过组织浴槽血管环法观察Kv3.4通道特异性阻断剂 BDS-I对15-羟二十碳四烯酸(15-hydroxyeicosatetraenoic acid，15-HETE)收缩肺动脉血管的影响，15-HETE引起肺动脉血管环张力增加，呈剂量依赖性;对缺氧组的大鼠肺动脉血管环张力作用更为明显，与对照组比较有显著性差异;除去肺动脉血管内皮后，15-HETE引起血管收缩的强度较内皮完整时增强，呈剂量依赖性收缩反应;通过阻断Kv3.4通道从而抑制收缩肺动脉血管环收缩。研究结果提示，Kv3.4通道参与由15-HETE引起的缺氧性肺动脉血管收缩。另有一项研究发现，Wistar大鼠和SD大鼠肺动脉血管环对缺氧(缺氧10 min)的反应不同，SD大鼠仅出现收缩反应，而Wistar大鼠在收缩前出现内皮依赖性舒张。

自发性高血压领域的血管环实验研究更多，大部分都是利用自发高血压大鼠进行研究。待动物的血压升高至一定的水平时，取材血管，制作血管环标本，进行实验。Ishida等［3］从mRNA和蛋白质水平证实了G蛋白耦联受体APJ及内源性配基Apelin在血管平滑肌有表达。Apelin可与血管内皮层的G蛋白耦联受体APJ受体结合，激活一氧化氮合酶，释放NO引起血管舒张，降低大鼠平均动脉血压［4］。Apelin对于剥除内皮的离体隐静脉也具有较强的收缩血管作用，其作用强度与AngⅡ相当。

刘厂辉等［5］研究G蛋白耦联受体APJ的内源性配体Apelin-13对自发性高血压大鼠离体血管环的血管收缩和舒张反应，以及与NO和细胞外信号调节激酶1/2信号转导通路的关系。结果显示，Apelin-13对于内皮完整的血管表现出浓度依赖性舒张作用。而对于去内皮血管则表现为收缩血管的作用。Apelin-13预孵育，可以减少自发性高血压大鼠和同源的WKY大鼠血管对新福林的缩血管反应性，增加对乙酰胆碱的舒张反应性;进而证实了NO通路和细胞外信号调节激酶1/2信号转导通路介导Apelin-13的舒张血管作用。

2.1.2 充血性心力衰竭 充血性心力衰竭的一个主要原因是体循环或者局部的血压过高，因此对血管舒张活性的调节也是一个重要的方面。氨氯吡咪是一种保钾利尿剂，临床用于利尿消肿、心源性水肿和非心源性水肿的治疗。陈媛等［6］采用KCl或者去甲肾上腺素预收缩的去内皮或者内皮完整的离体大鼠主动脉环，研究结果表明氨氯吡咪的血管舒张作用具有内皮依赖性，与内皮NO的合成有关;同时氨氯吡咪可能涉及血管平滑肌细胞的钙激活钾通道和内向整流钾通道的激活。

2.1.3 冠心病 冠心病涉及小动脉的痉挛，如何防止痉挛并使之再舒张是防治冠心病的一大措施，相应血管环的研究也已经大量开展。王延震等［7］分离了老龄和幼年犬的冠状动脉，进行17β-雌二醇对离体血管环收缩反应的研究，结果发现老龄犬冠状动脉血管环对雌激素的敏感性远远低于幼年犬，电压依赖性钙通道明显老化。

2.1.4 血管调控因子和离子通道研究 血管环的收缩舒张和很多血管调控因子有关，包括内皮性的各种因子，作用在平滑肌上的因子，以及钾离子通道、钙离子通道等。激活或者阻断某些调控的途径，可以引起血管的收缩或者舒张，因此利用血管环来进行机制研究也成为一种重要的手段。Francoise Goirand等采用C57B16小鼠来研究ATP依赖性蛋白激酶(AMP-dependent protein kinase，AMPK)亚型对小鼠胸主动脉的舒张作用。采用的小鼠是ATP依赖性蛋白激酶催化的 α1亚型缺失(AMPKα1－/－)或者ATP依赖性蛋白激酶催化的 α2亚型缺失小鼠，以及其同窝的对照小鼠。采用苯肾上腺素预收缩，然后加入梯度浓度的5-氨基-4-甲酰胺咪唑核糖核苷酸(5-aminoimidazole-4-carboxamide-1-β-D-ribofuranoside，AICAR)来考察 AMPK 的活性。结果发现，AICAR可以剂量依赖性地舒张预收缩的C57B16、ATP依赖性蛋白激酶催化的α1亚型AMPKα1+/+和ATP依赖性蛋白激酶催化的α2亚型AMPKα2+/+无缺失的小鼠的动脉血管环，这个舒张作用并不被腺苷受体拮抗剂所阻断。去除血管的内皮后，这个舒张作用依然存在，说明AICAR的作用靶点是平滑肌细胞。用L-单甲基精氨酸阻断一氧化氮的合成后，AICAR仍然可以引起血管的舒张，说明它也不依靠一氧化氮系统来舒张血管。AMPKα1－/－小鼠的动脉环对AICAR没有任何舒张反应，提示是AMPKα1的活性非内皮依赖性和非eNOS依赖性介导血管舒张作用［8］。

刘飞君等［9］利用大鼠肾动脉血管环、腹主动脉血管环、脑动脉环、冠状动脉血管环探讨药物是否具有器官血管选择性，结果发现KB-R7943浓度依赖性地舒张高钾除极所致的成年大鼠各器官动脉血管环，对各脏器血管无显著选择性。

2.1.5 脑供血不足 脑血管的血流量巨大，缺氧及一些内源性物质可引起动脉痉挛，脑供血不足，最终导致脑组织缺血及变性坏死。Edvinsson等［10］采用大鼠脑动脉模型进行降钙素基因相关肽抗体的研究，发现抗体的作用呈现内皮依赖性。作用于平滑肌细胞的α或β降钙素基因相关肽均可引起大脑中动脉浓度依赖的血管舒张。

此外，还可利用家兔脑锥基底动脉环，研究各种因素引起的血管收缩反应的影响。

2.1.6 内毒素休克 内毒素休克(endotoxic shock，ES)可引起急性循环功能衰竭，其病理学基础是细菌释放内毒素导致全身炎性反应，肺脏首发受累，最终以急性呼吸窘迫综合征、多系统器官功能衰竭危及患者生命。血管反应性改变是ES的主要病理特征之一。其中，血管对缩血管剂的反应性减弱或血管内皮依赖性舒张反应降低，都是血压反应性下降及循环衰竭的重要原因之一，并与ES患者病死率居高不下密切相关。血管环可较直观地显示血管对各种活性物质的反应，因此已广泛地应用到该领域。目前应用较多的是离体肺、体动脉血管环。

佟冬怡等［11］采用脂多糖孵育离体家兔肺动脉环和体动脉环建立ES模型。研究去甲肾上腺素和多巴胺对正常以及内毒素孵育后体动脉和肺动脉的血管张力反应性的变化。结果发现ES时，去甲肾上腺素在提升体动脉张力的同时，也同样程度地提升肺动脉张力，二者无显著性差异，对内毒素休克不利;而中剂量的多巴胺可使内毒素孵育肺动脉收缩减弱而体动脉收缩加强，对ES时的肺动脉高反应性和体动脉低反应性有利。

2.1.7 药物作用机制研究 离体血管环也较广泛地运用于药物作用机制的研究，例如复方丹参滴丸、杭白菊总黄酮、参麦注射液、黄芪、金雀异黄素、苦碟子、满山红水提物等。

王红娟等［12］利用家兔的主动脉血管环，对大豆黄酮的血管收缩作用进行了研究，发现大豆黄酮通过激活内皮上的M受体释放NO等引起舒张作用，该作用和胆碱能神经递质乙酰胆碱相似，具有内皮依赖性。秦纲等［13］从疾病预防的角度出发，利用大鼠的离体胸主动脉，观察大气PM2.5(也称细颗粒物，是指大气中空气动力学直径＜2.5 μm的粒子，这种污染物主要产生于交通、制造、能源等行业的高温燃烧过程中)。大量流行病学资料证明，PM2.5与心血管疾病发病、死亡密切相关。研究结果证明PM2.5可以加强PE对血管环的收缩作用，其机制可能与其通过氧化应激导致内皮细胞损伤有关。

二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)是一种含硫有机化合物，因其能溶解绝大多数有机化合物，因此作为反应溶剂广泛用于生物科研实验。王叶红等［14］研究了DMSO对离体大鼠胸主动脉的收缩反应，发现DMSO预处理后可以使氯化钙的量效曲线右移，提示DMSO可能通过抑制血管平滑肌细胞的钙离子通道而引起血管舒张。

2.2 血管生成活性研究 血管生成在很多生理和病理过程中发挥着重要的作用。肿瘤的生长和迁移，银屑病的发病等都与血管生成具有很大的关系。因此，目前利用血管环进行血管生成活性研究也是热点之一。近年来，评价抑制和促进血管生成的方法也有很大的进步，在分子水平、细胞水平、器官组织水平以及整体动物水平都建立了相应的模型，以评价血管生成的活性，形成机制以及药物作用靶点等。细胞水平测定，包括血管内皮细胞模型［15］及内皮细胞和肿瘤细胞共培养模型［16］。在器官组织水平经典的血管生成模型主要有鸡胚绒毛膜尿囊［17］、动物虹膜和无血管的角膜［18］等血管生成的体内器官组织模型。还有一种介于细胞水平和器官组织水平之间的培养大鼠主动脉环血管生成模型［19］。

2.2.1 抗肿瘤 血管生成在肿瘤发生、发展、浸润、转移等生物学过程中发挥重要作用。为了进一步研究肿瘤血管生成及其调控机制，分析血管生成促进或抑制因子活性的影响，验证针对血管生成进行的肿瘤治疗措施等，必须建立起肿瘤血管生成的研究模型。与体外实验相比，在体的血管生成实验虽然更贴近生理状态，但是耗时、费力、昂贵。体外的血管环生成实验已经被证明和生理状态环境具有一定的吻合性。

1984年，Nicosia首次报道动脉环血管生成模型;1990年，Nicosia等［19］首次将此模型应用到血管发生的研究中。取下大鼠主动脉后，剪成1 mm宽的血管环，再用纤维蛋白胶或者胶原蛋白胶包埋，然后以无血清的MCDB131培养液进行培养。培养过程中每天计算主动脉环产生的新生微血管数并进行定量分析。用不同胶培养的大鼠主动脉环新生血管的生长曲线不同。胶原包埋的主动脉环，培养1周时血管数达到顶峰，第2周开始萎缩。用纤维蛋白胶包埋时能使血管数顶峰期维持更长，且新生血管数是前者的2倍。

2002年Zhu等［20］将此方法改进，采用更薄的胶层包埋动脉环，使新生成血管染色更加方便;应用双重染色法和共聚焦显微镜在同一个层面上观察到内皮细胞、平滑肌细胞以及外周细胞共同存在并证明新生血管主要由内皮细胞构成。方法学的改进有利于血管生物学家更深入地研究血管生成的机制。动脉环取材广泛，观察方法简单，可以从分子水平阐明血管生长的分子调控机制，是较好的体外血管生成模型。

2004年 Wang等［21］建立了一种简明、可重复、可定量的新的技术来进行新生血管的定量分析，采用三维立体培养动脉环，用比色法来完成血管生成活性的定量测定。使用了常用的工具药如舒拉明、紫杉酮等作为受试物，通过与成像分析方法结果的对比，比色法的结果被证明是稳定可靠并可重复的。

2.2.2 动静脉吻合 对大鼠动脉环和下腔静脉环进行共培养，能形成微血管的吻合网络，因此，可用此模型来研究动静脉吻合发生的分子机制。但它不能完全真实反映肿瘤生长的微血管环境。另外，从不同种属和不同大小的动物体内取出的动脉环血管生成数差别很大，不好类比［22］。

3 结语

在新药的筛选和基础研究中，血管环的研究都是一个很重要的位置。在体动物研究完全是生理状态，可信度高，但是资源和时间方面耗资巨大。分子生物学和细胞学实验耗资小，可以快速进行筛选，但是和生理状态的差距过大，存在很大的局限性，而血管环这种半离体实验，处于一个承接的位置。和离体心脏研究、离体脏器(肝、肾、肺)研究一起，成为一个器官筛选平台，连接细胞学实验(包括分子生物学)和整体动物实验之间的通道，发挥着越来越重要的作用。血管环模型即将联合分子生物学、细胞学等领域的先进技术，不断改进创新，为相关科学研究提供更多的支持。

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