异基因造血干细胞移植中同种异体NK细胞的临床应用及研究进展

薛同圆，何颖芝，陆 艺，张佳佳，张轩煜，忻勇杰（综述），李玉华※（审校）

（1.南方医科大学第二临床医学院，广州 510515;2.南方医科大学珠江医院血液科，广州 510282;3.南方医科大学公共卫生与热带医学学院，广州 510515）

急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）是成人白血病的主要类型。AML患者化疗或移植后体内仍残存少量白血病干细胞，成为复发的根源。而近年来已有研究证明，同种异体自然杀伤（natural killer，NK）细胞输注治疗能有效降低AML患者的复发率，并提高其生存质量，这使同种异体NK细胞成为国内外近来研究的热点。在异基因造血干细胞移植（allo-hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT）中，通过杀伤细胞免疫球蛋白样受体（killer cell immunoglobulin-like receptor，KIR）-人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）错配原理，促使供者NK细胞产生对受者细胞的同种异体反应性，并介导对白血病干细胞的杀伤作用。这将指导造血干细胞合适配型供者的选择以及淋巴输注治疗，降低移植后微小残留病的复发，提高长期生存率，为改善AML患者生存质量带来曙光。

1 KIR的结构及KIR与HLAⅠ类分子的结合

KIR基因位于染色体19q13.4，它含有2 个（KIR2D）或3个（KIR3D）胞外 Ig样结构域。形态上，可分为介导活化性信号的短（S）胞质内尾端（KIR2DS和 KIR3DS）和介导抑制性信号的长（L）胞质内尾端 （KIR2DL 和 KIR3DL）［1］。目前KIR基因家族包括19个基因型，其中抑制型为KIR2DL1-3、KIR3DL1-3，活化型为 KIR2DS1-5、KIR3DS1 和KIR2DL4［2］。L 型胞质区含有1～2个免疫受体酪氨酸抑制基序，可趋化SHP-1，介导抑制性信号;S型胞质区不含免疫受体酪氨酸抑制基序，其跨膜区含带正电荷的天冬氨酸残基，可以结合凋亡相关蛋白，介导活化性信号［3］。

KIR可与多种HLAⅠ类分子结合。HLA-C被KIR2DL1、KIR2DL2和 KIR2DL3识别，HLA-B被KIR3DL1识别，HLA-A被 KIR3DL识别，HLA-G被KIR2DL4识别［4］。其中最主要的配体为 HLA-C位点编码的分子。KIR2DL2/3识别C1表位，KIR2DL1识别C2表位［5］。类似HLA-B位点编码的所有分子中，仅Bw4表位是KIR3DL1的配体。

2 allo-HSCT中NK细胞的同种异体反应性

在allo-HSCT中，如果受者细胞不表达供者HLAⅠ类分子，则供者NK细胞的杀伤作用不能被抑制，它们就可能通过KIR-HLA错配来促使其产生对受者细胞的同种异体反应性，并介导靶细胞（肿瘤细胞、病毒感染细胞等）的杀伤作用［6］。其中，同种异体NK细胞介导移植物抗白血病（graft-versus-leukemia，GvL）效应，并降低移植物抗宿主病（graft-versushost disease，GvHD）发生率。

研究发现，在allo-HSCT中，供者同种异体NK细胞清除受者白血病细胞，即GvL效应［7］。对此可能的解释是HLA错配移植时，灌注大量（比HLA配型移植时多5～20倍）CD34+造血干细胞，可能会提供一个供者类型主导的骨髓微环境。在这种条件下，受者 NK 细胞被“许可/驯化”［8］（licensed/educated，即指成熟期NK细胞识别自身HLAⅠ类分子以获得全部效应功能），这将最终导致供、受者NK细胞都具有同种异体反应性，特异性杀伤受者靶细胞（“missingself”识别）。这不仅永久清除了受者淋巴造血细胞，也立即破坏/清除了骨髓基质细胞［9］。因此，NK细胞在骨髓微环境中成熟。体外实验证实，同种异体NK细胞可在allo-HSCT中介导GvL效应，特异性杀伤AML细胞，从而控制其恶化［10］。

同时，同种异体NK细胞也可以清除抗原递呈细胞，使抗原无法递呈给T细胞，从而降低GvHD的发生率。Ruggeri等［11］获得小鼠体内的直接证据指出，输注同种异体NK细胞并不能引发GvHD，而输注同种异体T细胞则能引起严重的GvHD，导致对小鼠组织细胞的杀伤。Willemze等［12］证明了GvHD方向的KIR错配严重减少了疾病恶化概率，并提高了白血病患者（尤其是AML患者）生存率。

同种异体NK细胞通过杀伤受者白血病细胞（GvL效应）改善移植物植入性，通过清除受者抗原递呈细胞降低GvHD的发生率。因此，与同种异体T细胞不同，在allo-HSCT中同种异体NK细胞介导的GvL效应和降低的GvHD发生率使其特别适合移植。

3 allo-HSCT中同种异体NK细胞的临床应用

3.1 选择最佳同种异体NK细胞供者 体内研究、鼠类模型和临床试验的联合证据指出，NK细胞介导异源性反应需要任意一种KIR配体（C1、C2、Bw4）GvHD 方向错配的“missing-self”识别［12］。在 allo-HSCT时，同种异体 NK细胞供者应以 HLA分型（HLA-C1型、HLA-C2型、HLA-Bw4型）为选择的基础，受者至少不能表达供者KIR配体的一个等位基因组。并且供者范围的寻找也正不断扩大，从家族直系亲属（父母和同胞）至其他成员，寻找合适供者的可能性超过60%［13-15］。

然而，近来研究已经对这种“missing-self”识别机制作出细微改良。在一个KIR3DL1-Bw4相互作用的研究中，Moretta等［16］已经表明，KIR受体、配体的多态性都影响抑制性相互作用的有效性，从而影响抑制性信号，当KIR3DL1识别HLA-Bw4等位基因大量位点（除B*1301、1302）和一些Bw4阳性的HLA-A等位基因（A*2301、2402、3201）产生强烈的抑制性信号时，其他等位基因仅提供微弱的抑制性信号，如HLA-B*1301和 HLA-A* 2501。同时，表达KIR3DL1的NK细胞克隆频率也因此受到影响［14］。

综上所述，最佳供者的选择基于NK细胞同种异体反应性程度的评估。近来研究表明，KIR受体、配体的多态性通过影响抑制性相互作用，而影响抑制性信号和表达KIR不同亚型的NK细胞克隆频率。大量供者NK细胞克隆和对受者靶细胞的细胞毒作用检测，可以发现最佳同种异体NK细胞供者［15］。

3.2 同种异体NK细胞治疗白血病 Moretta等［16］研究表明，对抗白血病细胞的同种异体反应性由抑制性和活化性KIR传递的整合信号调节。近年来研究表明［17，18］，C1、C2 表位和它们的 KIR2DL 抑制性受体相互作用，KIR2DL1特异性识别 C2表位，KIR2DL2/3特异性识别C1表位。为此，研究者作了以下对比试验［19］:①KIR2DL1+同种异体NK细胞杀伤C1/C1+白血病细胞，而不杀伤C2/C2+白血病细胞。②KIR2DL1+和KIR2DL2/3+共表达的同种异体NK细胞对C1/C1+和C2/C2+白血病细胞都不杀伤。③KIR2DL2/3+同种异体NK细胞微弱杀伤C2/C2+白血病细胞，而不杀伤C1/C1+白血病细胞。④KIR2DL2/3+NK细胞只要共表达KIR2DS1，就能杀伤C2/C2+白血病细胞，而不杀伤C1/C1+白血病细胞。在C1错配的allo-HSCT中，KIR2DL2/3+NK细胞微弱杀伤C2/C2+白血病细胞。这说明了KIR2D2/3不仅识别C1表位，也能微弱识别C2表位。

Chewning等［20］报道，缺失 KIR2DS1供者的 NK细胞中，对C2表位“missing-self”的同种异体反应性应答很少发现。这表明KIR2DS1能识别C2表位并作为活化性受体杀伤靶细胞。在C1错配（同种异体NK细胞亚群为KIR2DL2/3+）的allo-HSCT中，接受KIR2DS1+供者半相合allo-HSCT的4例患者都得以存活并处于完全缓和状态。然而，接受缺失KIR2DS1供者半相合allo-HSCT的4例患者中有3例发生致命恶化［18］。这些数据强有力的支持了KIR2DS1介导白血病细胞杀伤的大量临床试验。

然而，另一些研究表明，KIR2DL2/3+同种异体NK细胞亚群极为稀少，仅见于C1纯合的个体中（该个体缺少C2表位）［9］。但是，由于受者的HLAⅠ类分子必包含C1表位，使得C1纯合的供者NK细胞无法具有对受者细胞的同种异体反应性，因而无法识别“missing-self”，更不能杀伤靶细胞。然而，拥有所有三种KIR配体（HLA-C1、C2和Bw4）的受者，也许会从C1纯合的KIR2DS1+同种异体NK细胞供者的半相合移植中受益［21］。但这种可能性还需要深入研究，因为它对成人AML半相合移植并不适用。在分析供者NK细胞对抗缺失C1表位靶细胞（PHA母细胞或AML细胞）的同种异体反应性时，同种异体NK细胞克隆频率在KIR2DS1-negative和KIR2DS1-positive供者中无显著性差异，且它们的杀伤效率一致。

抑制性作用有赖于NK细胞/靶细胞相互作用产生的活化信号强度。由于KIR2DL2/3与C2表位的低亲和性而产生微弱的抑制作用，使其仅微弱杀伤靶细胞。而在KIR2DS1与C2表位强活化信号的同时作用下，同种异体NK细胞即高效杀伤靶细胞。

AML是成人白血病的主要类型，近年来研究也表明［22］，同种异体 NK细胞输注治疗能有效降低AML患者的复发率并提高其生存质量。牛新清［23］研究发现，人AML细胞株KGlA可能是研究白血病干细胞很好的细胞模型，因为这些KGlA细胞表达CD34而不表达CD38。并且，其通过流式细胞仪检测得出KG1A细胞表面存在的主要为KIR2DL1配体，推测KIR2DL1可能为NK表面导致其对KG1A低杀伤的主要抑制性受体，但国内尚未有研究证明。

4 结语

增强机体免疫细胞杀伤白血病效应成为研究的热点。而NK细胞是机体天然免疫的主要承担者，具有天然杀伤肿瘤细胞的能力。通过KIR-HLA错配原理，增强NK细胞杀伤白血病细胞效应，有助于选择同种异体反应性造血干细胞移植供者的合适配型，更好地发挥NK细胞天然免疫的能力，降低白血病的瘤负荷，减少复发概率，改善预后和患者的生存质量。

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