间接比例法检测结核杆菌药物敏感性试验影响因素探讨＊

曹鸿远 王槐堂

湖北省咸宁市结核病防治所 437100

间接比例法检测结核杆菌药物敏感性试验影响因素探讨＊

曹鸿远 王槐堂

湖北省咸宁市结核病防治所 437100

目的：探讨间接比例法检测结核杆菌药物敏感性试验的影响因素。方法：通过对我室2009、2010年两次参加国家结核病参比室组织的结核杆菌药物敏感试验室间质评的结果进行比较与分析,找出影响实验成败的关键因素包括含药培养基配制的质量控制、实验过程的规范化、环境温度的实时监测、结果观察及判断等等,为以后的实验提供技术支持。结果：2010年与国家结核病参比室的药敏结果符合率比2009年有较大的提高。结论：培养基的质量、培养的温度和操作人员的技术娴熟程度均会影响药敏试验结果。关键词 间接比例法 结核杆菌 药物敏感试验 影响因素

结核杆菌药物敏感试验的结果准确与否是影响第五轮全球基金耐多药控制项目病人发现及其治疗方案制订的关键因素。本室于2009年8月和2010年3月两次参加了国家结核病参比实验室组织的结核杆菌药物敏感性试验室间质评活动,完成了62株(每年31株)结核杆菌药物敏感性试验的检测工作。现将检测情况总结如下。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 检测菌株均由国家参比室提供,由湖北省参比实验室转种后下发给本室培养,第31株为标准结核分枝杆菌H 37Rv敏感株,用以检测含药培养基质量。

1.2 药敏培养基的制备 按湖北省参比实验室的统一要求配制。含药培养基分别为 INH/RFP/ SM/EMB,阳性对照培养基为改良罗氏培养基。对照培养基及含药培养基配制方法均按照WHO《结核病控制实验室工作手册(1998)》中的有关规定执行[1]。2～8℃贮存,3个月内使用。

1.3 实验操作 用间接比例法,每份标本及每种药均接种两支菌量分别为10-2、10-4CFU/管[2]。2009年31株菌株分别于7月14日(10株)、19日(7株)、27日(12株)、31日(2株)四次接种,分别放置于36.5℃两个培养箱内,其中在14、19、31日接种的19株菌株的培养箱温控器于8月1日18点以后突然失灵,8月2日上午8时笔者观察时箱内温度显示45℃,维持时间小于14h,续将这19株菌株转移至36.5℃培养箱中继续培养,至4周观察结果。2010年31株菌株,一次性接种放置于36.5℃培养至4周观察结果。

2 结果

2.1 阳性对照生长情况 2009年31株标本中,由于有19株标本受温控器失灵导致的短期温度升高的影响,因而各时间段接种的标本阳性对照的生长情况有一定差异：7月7日接种的12株(每株2管,以下同)阳性对照中有23管生长良好,其中一株-2浓度未生长,但-4浓度1+;温控器失灵的培养箱内的19株标本中,7月14日接种的10株标本,阳性对照生长的有8株计14管,两株-4浓度对照管未生长;19日接种的7株标本中阳性对照生长的有2株(其中一株为 H 37Rv敏感株)中的-2浓度管,但只有几个菌落,-4浓度管无菌落生长,31日的2例阳性对照无一生长。2010年的31株标本,阳性对照中有58管生长良好,一株-2浓度管未生长,但-4浓度管2+,3株-4浓度管未生长,H 37Rv敏感株阳性对照生长良好;两种浓度阳性对照菌落生长融合未显出明显浓度差异3例。

2.2 污染情况 2009年检测的标本中-2浓度管全部污染1例;2010年检测的无污染。

2.3 计算耐药百分比 若耐药百分比＞1%则认为受试菌对该抗结核药耐药,≤1%则为敏感[2]。本文主要统计与国家参比室结果的符合率。由于2009年的31株标本阳性对照生长的只有22株,因此其药敏结果的比较只能以22株来计算,与国家参比室的结果相比符合株数比依次为INH 18/22、RFP17/22、SM4/22、EMB 5/22;2010年 INH 29/31、RFP28/31、SM26/31、EMB 25/31。

3 讨论

3.1 部分阳性对照未长 (1)温度的影响。从以上结果观察中可看出：在结核杆菌培养过程中,相对短期的45℃环境,对经36.5℃环境培养时间在2周以内的9株标本影响极大,阳性对照生长率为2/18,但对36.5℃环境培养时间超过2周的标本影响相对较小,阳性对照生长株数比为16/20。这可能因为结核分枝杆菌是慢生长菌,代期较长;此外细菌的初期生长有其一定的生长调整周期,这一时期内受环境温度影响较大。以后细菌进入对数生长期,短期的温度略升,对细菌的生长繁殖影响相对较小。(2)菌落未磨匀、稀释不均匀、接种环挑取了空泡等也是造成部分对照不生长的主要原因。

3.2 未显出明显浓度差异 配制1mg/m l浓度菌液时菌量过多,两浓度阳性对照培养基的生长程度均在3+～4+。

3.3 污染 -2浓度全污染1例,且菌落生长特征相同,经革兰氏染色证实为真菌污染。本例低浓度培养管未见污染,接种环境污染应可排除,可能首先接种的阳性对照培养基在贮存过程中被污染但未被发现,后仍经依次接种导致本例整个-2浓度培养基被污染。

3.4 结果观察与判断的难点 通过这两次测试,结合平时的实验观察,发现：(1)少数菌株无论是在阳性对照还是含药培养基上在四周的报告期限内菌落生长不明显,延迟1～2周可获明显结果。此类菌株生长速度更为缓慢,但延长时间观察是否会影响结果的准确性却值得探讨。(2)绝大多数耐药菌株耐药百分比均较大,但偶有临床提示疗效欠佳(治疗3个月末仍菌阳)而药物敏感实验结果显示利福平0＜耐药百分比≤1%的病例,重复实验结果仍然相同。此类标本用绝对浓度法检测是否为RFP低浓度耐药,高浓度敏感尚不得而知。但有文献报道,比例法和绝对浓度法在检测结核分枝杆菌对1NH、RFP和 EMB的药物敏感性时差异有统计学意义[3]。

3.5 2009年阳性对照生长良好的20株标本SM、EMB全部耐药,与国家参比室的结果相比符合株数比却分别只有4/22,5/22。因同批H37Rv敏感株受温度影响较大,其结果不能作为评价含药培养基质量的依据,结合同时参加这两次试验的其他实验室的结果,推测可能为含药培养基的配制问题。

3.6 SM、EMB与国家参比室的结果相比仍未达到符合率90%的要求,其原因仍有待分析。

4 对策

根据参加结核杆菌药物敏感性试验室间质评结合本室平时结核杆菌培养和药物敏感性试验的经验,笔者认为提高结核杆菌药物敏感性试验准确率要注重做好下列工作。

4.1 培养基的配制及保存 培养基的配制主要注意各药物的质量、称量的准确性、稀释比例的正确与否及灭菌的温度和时间等;培养基应在2～8℃低温保存且不超过3个月,不得暴露在紫外线下。

4.2 实验过程的规范化 (1)做好实验室环境及实验器材的消毒灭菌工作。(2)防范交叉污染。批量测试时在磨菌、稀释及接种过程中均有产生交叉污染的可能。特别是要防范粘有菌液的塑料接种环弹出试管外引起交叉污染和环境污染。(3)1mg/m l菌液的配制：首先挑取尽可能大范围的菌落,以防漏掉可能的变异株;其次挑取菌落时不得杂有培养基,菌落要尽可能磨匀,并取适量生理盐水冲洗磨菌棒及管壁后混匀放置,待未磨匀的粗大颗粒沉淀后取液体上部混悬液稀释比浊,稀释管与标准比浊管材质及大小要尽可能一致,便于肉眼比浊。(4)接种菌液前先观察培养基是否新鲜,有无污染,稀释与接种时均要注意稀释是否均匀,挑取菌液是否足量,有没有挑空环或气泡。用划线法接种注意尽可能使菌液均匀分散于培养基斜面。

4.3 每天作好培养环境温度的监测 将培养箱的温度控制在(36.5±1)℃。结核分枝杆菌复合群的最适生长温度为35～37℃,而有些类型的分枝杆菌在25℃、30～33℃或45℃也可生长[4]。

4.4 结果观察时两浓度阳性对照管应显示明显的浓度梯度,以此作为判断菌液稀释比例正确与否在观察结果时,无论是在这两批次的测试中,还是在日常的药敏检测中也常见菌株生长速度不一的现象。有的菌株生长快速,在1周内生长的多为非典型分枝杆菌,在PNB培养基中可生长,据此可与结核分枝杆菌复合群相鉴别[5],2008-2010年本室检测出非典型分枝杆菌7例,其中痰标本5例,尿标本2例,菌落初次生长时间均小于7d。

[1] 端木宏瑾,屠德华,张培云,等.临床技术操作规范〔M〕.北京：人民军医出版社,2004：32-34.

[2] 王陇德,刘剑君,姜世闻.结核病防治〔M〕.北京：中国协和医科大学出版社,2004：108-109.

[3] 武杰,桂晓红,等.比例法与绝对浓度法检测结核分枝杆菌药敏试验的比较〔J〕.中华检验医学杂志,2011,34：137-138.

[4] 谢惠安,阳国太,等.现代结核病学〔M〕.北京：人民卫生出版社,2000：99-103.

[5] 马玙,朱莉贞,潘毓萱.结核病〔M〕.北京：人民卫生出版社, 2006：109-110.

The Proportion of Indirect Detection of Mycobacterium Tuberculosis Drug Susceptibility Testing of Factors

CAO Hongyuan,WANGHuaitang.TBControlCenterofXianningCity,HubeiProvince437100

Objective：To explore the influence of indirect proportion method in testing Mycobacterium tuberculosis.Methods：Mycobacterium tubercu losis d rug suscep tibility testing resultsw ere com pared and analyzed to identify the key fac tors of success or failure of experiments,including preparation of the quality of the drug-containing medium control, experimental process of standardization,real-timemonitoring of the ambient temperature,the results of observations and judgments,etc.Results：2010 national TB reference room with suscep tibility results consistent with a greater rate than the increase in 2009.Conclusion：The quality of themedium,culture temperature and skilled operators will affect the degree of suscep tibility test resu lts.

Indirect proportion method,Mycobacterium tuberculosis,Drug sensitivity test,Factors

R446.5

A

1001-7585(2011)10-1121-03

国家第五轮全球基金耐多药结核病防治项目

2011-03-23

(编辑江山)

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