间充质干细胞体外分化为胰岛β细胞的影响因素的研究进展

禹亚彬，储 建，章世海（综述），卞建民（审校）

（南京医科大学附属南京市第一医院普外科，南京 210000）

1型糖尿病和全胰切除术后的患者体内胰岛素绝对缺乏。通过把有功能的胰岛β细胞移植入体内来治疗胰岛素绝对缺乏最近几年来引起了广大研究者浓厚的兴趣，然而胰岛移植面临着供体有限、免疫排斥等问题。已经有实验证明了通过诱导胚胎干细胞以及胰腺、肝脏、小肠上皮中的干细胞可以较容易地获取产胰岛素细胞，但是所获取的细胞不能随着葡萄糖浓度的波动产生动态反应，免疫排斥，以及肿瘤形成这些问题仍然存在。间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）与组织干细胞以及胚胎干细胞相比具有相当大的优势。MSC分化潜能巨大，不会引起免疫反应，体外可以培养扩增超过60代［1］，移植后组织学观察也未发现肿瘤形成。因此，把MSC作为胰岛β细胞的来源具有极大的应用前景。从骨髓、脐带等组织中分离而来的MSC要想成功地分化为胰岛β细胞尚要考虑以下这些因素。

1 细胞间接触对MSC分化为胰岛β细胞的影响

在体外，MSC分化为成熟的胰腺内分泌细胞与三维空间的形成密切相关。可能的原因是细胞簇通过与邻近的细胞更多的接触来加快分化进程、促进受诱导细胞的成熟。细胞外基质凝胶拥有丰富的胶原和层粘连蛋白，为三维结构的形成提供了基础。Gao等［2］的研究发现，在细胞外基质凝胶上培养的由脐带血间充质细胞（umbilical cord blood mesenchymal stem cell，UCB-MSC）分化来的细胞在形态学上更像β细胞。当UCB-MSC在缺乏ECM gel培养的条件下被诱导时，它的分化停留在很早的阶段，在培养15 d后看不到胰岛样的细胞簇，也检测不到功能性蛋白的分泌。

Huang等［3］的实验发现，用不用胎牛血清包被的培养瓶培养对UCB-MSC分化影响差别显著。这可能是由于胎牛血清中像纤连蛋白、胎球蛋白、转铁蛋白这样的蛋白加速了细胞间黏附，另外，转铁蛋白和铁结合还降低了细胞毒性。

2 高糖培养基对MSC分化为胰岛β细胞的影响

一般认为低糖培养液可以很好地促进细胞生长和增殖，而高糖培养基则不能。高糖培养基的影响可能是通过三个途径:①破坏细胞膜的稳定性;②影响细胞生长的微环境;③改变细胞内外渗透压。但是，高浓度的糖却被认为是MSC分化为胰岛样细胞强有力的诱导剂［4］。高浓度葡萄糖不仅可以增强胰岛β细胞胰岛素基因的表达，还可以刺激干细胞向胰岛素分泌细胞分化［5］。因此对于MSC而言，在合适的时间添加高糖培养基来诱导其向胰岛β细胞分化极其重要。

3 培养基pH对MSC分化为胰岛β细胞的影响

高糖培养基H-DMEM容易变碱，而IMDM缓冲能力强，基本保持偏酸性。由于MSC一直生活在偏酸性的DMEM/F12培养基中，所以将其逐渐过渡到与之性质相似的IMDM中，既有利于细胞的生长，又提供了细胞分化的必要条件［6］。

4 在培养基中添加某些化学试剂可以促进MSC分化为胰岛β细胞

一般认为，尼克酰胺可以通过抑制ADP核糖体多聚酶活性来保持胰岛细胞的活力和功能。Chen等［7］实验中发现单独的高糖并不能使MSC分化为胰岛样细胞，但添加尼克酰胺后MSC则易转化为胰岛样细胞。这意味着尼克酰胺可能是有效的诱导剂，它能保护分化的细胞死亡或者转变为其他类型的细胞。神经元细胞和胰岛内分泌细胞在起源上邻近，都来自于内胚层。神经细胞可能是干细胞分化为胰岛分泌细胞的过渡状态［8］。神经细胞特异性表达巢蛋白，已有一部分学者先将干细胞培养分化为巢蛋白阳性细胞，然后再将其诱导为胰岛β细胞［9，10］。β巯基乙醇通常被认为是神经细胞的诱导剂。Chen等［7］添加β巯基乙醇增加了试验中尼克酰胺的效能。

另外，尚有学者在培养基中添加银杏提取液，主要是通过增强受诱导细胞在高糖环境中的抗凋亡作用来促进其向胰岛β细胞分化［11］。

5 细胞因子在MSC分化为胰岛β细胞中的作用

碱性成纤维生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）是神经营养因子的一种，其靶细胞主要分布于中胚层与神经外胚层，但也能促进内胚层衍生物的有丝分裂。已知bFGF在很多报道中都作为胰岛素分泌细胞的诱导剂使用，但其作用机制尚不明确。bFGF本身没有信号肽，不能外分泌，通常在细胞死亡、细胞膜受到理化损伤时才被释放到胞外［12］，或许在高糖培养基中添加bFGF可以模拟一种损伤的内环境来促使细胞增殖和分化。表皮生长因子是一种多功能的生长因子，在体内、体外都对多种组织细胞有强烈的促分裂作用。王越春等［6］发现，仅使用常规浓度的表皮生长因子和bFGF作为诱导分化剂，就可以使脐带间充质干细胞（umbilical cord mesenchymal stem cell，UC-MSC）在高糖培养基中较快地发生形态学变化，并且在细胞内和血清中都可以检测到较高浓度的胰岛素。虽然诱导而来的产胰岛素细胞功能还不够成熟，难以分泌足够的胰岛素，但此法初步显示了其简便、快速、高效和安全的特点。

乙胞素属表皮生长因子家族，它在调节胰腺内分泌细胞前体的增殖和分化方面起着重要的作用［13］。有研究表明，乙胞素可促进β细胞前体的增殖及向β细胞分化［14］，而且乙胞素可以通过上调Pax4的表达来促进胰腺/胰岛细胞的增殖、分化［15］。

另外，活化素A是转化生长因子β超家族的一个成员，它能调节体内 β细胞的再生［13，16］。胰高血糖素样肽及其类似物Extendin4，被认为具有刺激β细胞复制和导管细胞再生的能力［2］。转化生长因子α能诱导β细胞增殖但不能诱导其分化;胰岛素样生长因子能促进导管细胞分化和胰岛细胞增殖。

6 利用转基因方法可以促进MSC分化为胰岛β细胞

PDX1、BTC基因在MSC分化为胰岛β细胞中起着重要的作用。PDX1可以调节大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cell，BM-MSC）分化为产胰岛素细胞，Yuan等［17］通过胰岛素释放试验发现，经过PDX1 cDNA转染的MSC受到葡萄糖刺激后胰岛素的分泌，通过双硫腙染色可以看到胰岛样的结构被染成黑红色，而PDX-1表达阴性的细胞受葡萄糖刺激后没有胰岛素的分泌，双硫腙染色也看不到胰岛样的结构。Li等［18］的研究中MSC被携带大鼠PDX1和BTC基因的质粒转染，结果显示PDX-1与BTC同时表达显著增加了MSC分化为巢阳性上皮样前驱细胞和胰岛样球状体的能力。同时表达PDX-1和BTC的MSC胰岛素和GLUT-2 mRNA的表达显著上升，并且可以在葡萄糖刺激后分泌胰岛素和C肽。转基因BTC比直接添加BTC要好，因为它能提高细胞与细胞之间的接触。

Notch基因在MSC分化为胰岛β细胞过程中亦发挥重要的作用。Hu等［19］的实验中UCB-MSC被转染表达Notch受体和配体的基因。与对照组相比，转染后的细胞在分化过程中Notch信号的过度表达导致了胰岛素基因、胰岛素原、胰岛素阳性细胞表达的下调。还有其他一些研究表明，Notch信号控制着胰腺的分化［20，21］，这些研究指出MSC分化为产胰岛素细胞受Notch信号显著影响，然而并不知道这些细胞是否表达Notch信号组分以及分化的具体机制。

7 结语

临床上全胰移植以及胰岛移植的成功证实了胰岛β细胞替代疗法的可行性，这使得1型糖尿病和全胰切除后的患者可以不再使用外源性胰岛素［22］。MSC不存在伦理学问题，并且具有免疫调节优势，因此把MSC作为胰岛β细胞的再生源具有较好的应用前景。影响MSC体外分化为胰岛β细胞的因素错综复杂，但可以肯定的是细胞外微环境和内在的基因决定着MSC的命运。虽然MSC经诱导后可表达胰腺内分泌细胞的标记并能分泌胰岛素，但对其分化机制尚未完全清楚，目前还不存在所谓的标准及完善的诱导方案，对诱导剂的使用剂量、浓度、使用时间、作用时间还需要进一步探索。现在众多研究培养出的胰岛β细胞在动物体内尚不能很好地根据血糖的动态变化来发挥功能，正如使用外源性胰岛素并不能模拟生理性胰岛素的分泌。因此，还需更多地对体外影响MSC向胰岛β细胞分化的因素进行研究，尽可能地模拟体内β细胞成熟的环境来获得拥有完整功能的β细胞。

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