大鼠颌下腺细胞降钙素的定位研究

张永莉，李社莉，李宝莉，王炎林，施秉银，吕双燕，李亚

（1.延安大学附属医院内分泌科，陕西 延安 716000；2.延安大学医学院，陕西 延安 716000；3.西安交通大学第一附属医院内分泌科，西安 710061）

近年来，随着分子生物学的飞速发展，以及原位杂交免疫组化等先进技术的广泛应用，人们在颌下腺中陆续发现或分离提取出30多种生物活性物质，它们或直接分泌入血，或随唾液进入消化道再由胃肠吸收入血，对多种组织和细胞的生理活动起调节作用。其中有些因子完全达到激素的标准，故有人提出颌下腺具有内分泌和外分泌双重功能。我们先前曾用免疫组化的方法观察到大鼠颌下腺内含有降钙素（calcitomin，CT）免疫反应阳性细胞［1］，这就意味着颌下腺能分泌降钙素，为了证实这一结果，我们设计了本实验。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：8 d生SD雄性大鼠，由西安交通大学医学院动物实验中心提供。

1.1.2 试剂：DMEM/F12培养液，由赛默飞世尔生物化学制品（北京）有限公司生产；胎牛血清，由兰州荣晔生物科技有限责任公司生产；兔抗角蛋白单克隆抗体（CK-8），北京博奥森生物技术有限公司产品；兔抗CT抗血清 由美国NeoMarkers公司生产；SP免疫组化染色试剂盒及DAB显色剂，由北京中杉金桥生物技术有限公司提供；敏感性加强型原位杂交检测试剂盒Ⅰ型为武汉BOSTER公司产品；地高辛标记的CT DNA寡核苷酸探针由北京奥科生物技术有限责任公司合成。

1.2 方法

1.2.1 大鼠颌下腺细胞培养方法：在无菌条件下，大鼠断颈处死后获得颌下腺，剪碎、消化、离心，用差速黏贴法清除纤维细胞，接种于培养瓶中培养，2～3 d后首次换液，8～9 d后进行传代培养，倒置显微镜下进行观察。

1.2.2 免疫细胞化学SP法鉴定细胞来源及进行降钙素的细胞定位：取培养第5天的细胞爬片，4%甲醛固定，采用免疫细胞化学SP法，按试剂盒说明操作，兔抗鼠CK8抗体及降钙素一抗的浓度分别为1∶400和1∶25。阴性对照：用PBS代替一抗，相同条件，同批次染色，镜下观察。

1.2.3 CT原位杂交：用多聚赖氨酸处理过的盖玻片进行细胞爬片，细胞长满95%～100%时取出，按试剂盒说明操作，阴性对照：用不含探针的杂交缓冲液代替含探针的杂交液，镜下观察。

1.2.4 CT探针的引物设计与合成：根据GenBank上登录的哺乳动物的氨基酸保守区来设计，由北京奥科生物技术有限责任公司合成，为5，DIG修饰，碱基数31 个，分别是：5′-CCCATAATAGCCCAGAG AACAGCCAGAGAGG-3′，引物的 Tm 值 70.8，包含的碱基个数：A12 G8 C9 T2，分子量9542。

2 结果

2.1 颌下腺细胞的形态

倒置显微镜下见体外培养的原代腺细胞第3天开始细胞贴壁、伸展变形，有的形成克隆，增殖的细胞呈形态一致的立方形，多边形和圆形，8～9 d后见细胞长满培养瓶的80%，呈集落生长，鹅卵石样排列（图1），可传代培养。传代细胞形态与原代相似。

2.2 CK8及CT免疫细胞化学结果

细胞爬片进行所培养细胞的来源鉴定，分别用兔抗角蛋白单克隆抗体（CK-8）及兔抗鼠CT作为一抗，用SP免疫组化染色试剂盒进行染色，DAB显色。CK8免疫细胞化学结果显示：免疫反应阳性细胞，胞质呈黄色或棕黄色，胞核呈蓝色，背景不着色，阳性细胞很易鉴别。阴性对照片，细胞质不着色，呈阴性反应（图2，4）。颌下腺细胞CT免疫细胞化学结果：免疫细胞化学阳性细胞胞膜和胞质呈黄色，着色好，胞核呈蓝色（图3），阴性对照不着色（图4）。

2.3 CT原位杂交结果

杂交信号阳性细胞胞质呈蓝紫色，细胞核呈红色，背景不着色，阳性细胞很易辨认。在所培养的大鼠颌下腺细胞CTmRNA杂交信号分布很广泛，而且一致，信号物质位于颌下腺腺泡细胞的细胞膜及胞质内，胞核呈阴性，阴性对照片细胞质未染色，呈阴性反应，胞核呈红色。（图5，6）

3 讨论

CT分布于甲状腺C细胞，它是调节体内钙磷代谢的重要激素之一。颌下腺属于消化腺，其可产生消化酶参与食物的初步消化。近年来人们发现颌下腺又可产生多种生物活性物质，参与机体多种生理功能的调节［2］，在大鼠颌下腺中的颗粒曲管细胞能合成、储存、释放近30种生物活性多肽，如上皮生长因子、血管舒缓剂、胰岛素、内皮素、肝细胞生长因子等［3］。陆续还有新的生物活性物质在大鼠颌下腺被发现。如：付建芳等［4］发现颌下腺有卵泡刺激素及黄体生成素的表达，陈蕾等［5］观察到大鼠颌下腺有黄体生成素及其受体的表达等。还有报道［6］促性腺激素释放激素及其受体可共存于颌下腺等组织中。我们先前曾用免疫组化的方法观察到大鼠颌下腺浆液性腺泡细胞及混合性腺泡的浆液细胞内含有CT免疫反应阳性物质，推测大鼠颌下腺可以合成和释放CT。为进一步证实上述推论，我们设计了本实验。通过体外培养大鼠颌下腺细胞，并用CK8抗体鉴定其确系上皮细胞来源，但是所培养的上皮细胞是否为浆液性细胞，不好确定；再用兔抗鼠CT一抗进行所培养大鼠颌下腺细胞的免疫细胞化学染色，结果显示颌下腺细胞呈CT免疫反应阳性，细胞质呈黄色或棕黄色，细胞核呈蓝色，确定其细胞质含有CT，与我们先前免疫组化结果一致［1］；用地高辛标记的CT寡核苷酸探针进行原位杂交，观察到：大鼠颌下腺细胞呈CT杂交信号阳性反应，细胞质呈蓝紫色，胞核呈红色，背景不着色。以往报道颌下腺分泌生物活性物质多采用免疫组化的方法，易出现假阳性结果。本实验是先前免疫组化研究的深化，首次从细胞水平及基因水平证实了颌下腺能合成和分泌CT，但通过何种细胞转导通路尚不得而知，有待进一步研究。我们推测：甲状腺与颌下腺以及胃肠胰同是由内胚层分化形成的，它们在结构和功能方面密切相关。因此，颌下腺上皮细胞与甲状腺C细胞可能为同源细胞，颌下腺也参与体内钙磷代谢的调节。

［1］戴光荣，张永莉，施秉银.大鼠颌下腺降钙素的免疫组织化学定位［J］.解剖学报，2006，37（1）：99-101.

［2］Mizrachi D，Shemesh M.Follicle-stimulating hormone receptor and its messenger ribonucleic acid are present in the bovine cervix and can regulate cervical prostanoid synthesis［J］.Biol Reprod，1999，61（3）：776-784.

［3］Gresik EW，Hosoi K，Kurihara K，et al.The rodent granular convoluted tubule cell-an update［J］.Eur J Morphol，1996，34（3）：221-224.

［4］付建芳，黄威权，王世鄂，等.大鼠下颌下腺卵泡刺激素、黄体生成素的分布及与促性腺激素释放激素受体的共定位研究［J］.解剖学报，2004，35（6）：652-655.

［5］陈蕾，白宏伟，孙绪德.大鼠颌下腺黄体生成素及其受体的定位、核心片段的克隆及序列分析［J］.解剖学报，2007，38（5）：572-576.

［6］于辉，唐旭，吕葆真，等.卵泡刺激素受体在大鼠下颌下腺及胃的定位和分布研究［J］.解剖学报，2006，37（3）：337-339.