成骨细胞胞内胞外碱性磷酸酶含量比较
2011-11-15张英袁月孙富丽
张英，袁月，孙富丽
（中国医科大学附属口腔医院综合急诊科，沈阳 1 1 0 0 0 2）
碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）广泛存在于机体各组织器官中，主要是肝、肾、胎盘、小肠和骨。人体血清中ALP主要由肝脏及成骨细胞合成（几乎各占50%），分别称为肝源性及骨源性碱性磷酸酶。ALP是成骨细胞所分泌的一种酶蛋白，是成骨细胞分化的特异性标志，是最常见评价成骨细胞分泌功能的指标之一。所以，ALP的检测结果对成骨细胞的研究有重要意义。目前检测ALP的实验方法很多，文献中常用的方法可概括分为2类：直接取成骨细胞的培养基进行检测、将成骨细胞破碎后进行检测。成骨细胞分泌的ALP是细胞内多还是在细胞外多，对实验方法的选择及实验结果都会造成一定影响。本实验就此问题进行研究。
1 材料与方法
1.1 实验动物与仪器、试剂
出生24 h的大鼠，雌雄不限，购自中国医科大学动物实验中心。主要仪器：超净工作台，培养箱，相差显微镜，低温离心机。主要试剂：DMEM培养基（GIBCO公司，美国），胎牛血清（sigma公司），HEPES（AM-RESCO 公司，美国），青／链霉素、Ⅰ型胶原酶（Sigma公司，美国），胰蛋白酶（GIBCO公司，美国），ALP染色试剂盒（碧云天公司），Ⅰ型胶原免疫荧光染色试剂盒（abcam公司，美国），ALP含量测定试剂盒（昊柏公司）。
1.2 成骨细胞的分离、接种与传代
采用酶交替消化法对成骨细胞进行分离［1］。将4只大鼠胎鼠浸泡于75%乙醇中5 min，取出后放入培养皿中，剥出颅骨，放入有双抗的PBS液中浸泡。移入超净台内，用PBS将取下的颅骨冲洗3次。加入0.25%的胰酶，重复3次加入2 mL（1 mg/mL）的Ⅰ型胶原酶交替消化；收集消化液，加入4 mL高糖培养基终止消化。低温离心机1 000 r/min离心10 min，弃去上清；将沉淀移入培养瓶中，加入5 mL10%高糖培养基；放入37℃5%CO2培养箱中培养1 h后，将培养瓶翻转过来。以后每3 d换1次培养液，每5~7 d传代1次。
1.3 成骨细胞鉴定
1.3.1 相差显微镜下观察细胞形态
1.3.2 ALP染色：将培养第4代的成骨细胞在盖玻片上爬片，多聚甲醛固定30 min。0.01 mol/L PBS洗3次，每次5 min。用碧云天ALP染色试剂盒染色，避光孵育24 h。
1.3.3 Ⅰ型胶原免疫荧光染色：用4%多聚甲醛固定30 min，应用abcam试剂盒染色，避光在荧光显微镜下观察。
1.3.4 茜素红染色：培养皿用PBS冲洗2次，95%乙醇固定10 min，双蒸水冲洗3次。0.1%茜素红-Tris-Hcl（pH 8.3）37℃，30 min。
1.3.5 ALP 含量测定：（1） 将传代后 1 d、2 d、3 d 的细胞分别设定为第1，2，3组，每组各取5瓶，将每瓶的培养液取出设为对照组；将相同培养瓶瓶底的细胞消化下来，使用超声波细胞粉碎机将细胞粉碎，设为实验组。（2）将1 mL反应液R1加到比色杯中，37℃孵育3 min后加入20 μL待测样品，搅匀并保温30 s。（3）加入 250 μL 反应液 R2到比色杯中，搅匀并保温30 s。（4）然后用酶标仪或分光光度计测定405 nm处2 min到10 min内的吸光度变化计算这2个时间点的OD值的差值，计算差值的平均值和标准差。
2 结果
2.1 相差显微镜下观察成骨细胞形态
接种前成骨细胞呈体积均一的圆形细胞，接种24 h后，少量细胞开始贴壁生长，显微镜观察贴壁生长细胞为长梭形或有2~3个突起，胞质透亮、饱满。部分细胞突起为3~4个，体积较前明显增大，似星形，显示出较好的贴壁性，部分区域出现重叠生长以及辐射生长的现象。第2代细胞贴壁后增殖加快，形态以不规则形、长梭形、三角形为主，相邻细胞彼此贴靠，细胞内及表面开始出现分泌物。见图1。
2.2 ALP染色结果
细胞均染色呈梭形、多角形，细胞质染色呈深蓝色。见图2。2.3 Ⅰ型胶原免疫荧光染色
细胞均染色呈梭形、多角形，细胞质染色发出红光。见图3。
2.3 茜素红染色
在显微镜下观察，细胞间分泌的钙结节被染成红色。见图4。
2.4 实验组和对照组ALP含量比较
实验结果说明：成骨细胞内分泌的ALP比成骨细胞外分泌的ALP高，差异有统计学意义。
分别对细胞内和细胞外的3组数据进行单因素方差分析，P值结果如下表：从表1可以看出：当第1天与第5天、第3天与第5天进行ALP含量比较时，如果将细胞破碎检测，结果有统计学意义，直接取培养液进行检测，结果没有统计学意义。故直接取培养液进行检测的方法可能降低了差异大小，最终影响实验结果的准确性。
表1 3组数据组间差异的分析结果（P）T a b.1 T h e a n a l y s i s r e s u l t s o f 3 d a t a g r o u p s（P）
3 讨论
ALP是Suzuki等在1907年首先发现的，生理作用是非特异性水解磷酸单酯键，最适pH值为8.6~10.3，因此称为ALP，临床上长期用作诊断肝、胆和骨组织疾病的实验室参数之一［2，3］。ALP主要产生于肝脏、骨和胎盘，也可产生于肾和小肠。有4种同工酶，分别为肝、骨、小肠和胎盘型。ALP广泛存在机于体各组织器官中，主要是肝、肾、胎盘、小肠和骨。ALP活性是很多细胞如成骨细胞、牙周膜细胞、牙髓细胞等的功能及分化程度的指标。在细胞中表达的多少，反映出细胞的分化程度和功能状态，因此定量检测细胞内的ALP活性具有非常重要的意义。ALP是成骨细胞所分泌的一种酶蛋白，活性的高表达是成骨细胞分化的特异性标志［4，5］，是最常见评价成骨细胞分泌功能的指标之一。ALP含量可以间接反应成骨细胞的功能，测定血清ALP含量可反映骨代谢活动。
目前，血清中ALP活性的检测方法已成熟并广泛应用于临床。而对体外培养的细胞内ALP活性的检测却缺乏统一的标准方法，并且研究较少。目前文献中关于体外培养细胞内ALP的检测方法有很多种，可概括分为2类：直接取成骨细胞的培养基进行检测，将成骨细胞破碎进行检测。由于各实验室条件不同，可以将后者分为反复冻融法破碎细胞［6］、使用Triton-X100［7］破碎细胞、使用超声破碎仪破碎细胞。直接检测培养基中的ALP这种方法［8］，操作简便，但成骨细胞内分泌的ALP比细胞外分泌的高，故该实验方法降低了各比较组之间的差异，外低于内从而从侧面影响实验结果的准确性，如表2。Triton-X100是一种非离子型表面活性剂，对细胞起到打孔的作用，实验方法简便［9］，但有化学试剂的参与将会对酶的活性或试剂的反应造成影响，而影响实验的准确性。反复冻融的方法检测ALP，属于物理的方法，没有化学试剂的参与，避免了对检测试剂盒的影响，并且该方法操作相对简单，但在反复冻融过程中容易对ALP的活性造成影响，从而影响了最终结果；本实验采用超声破碎仪破碎细胞，选用物理的方法破碎细胞，在破碎同时使用凉水物理降温，尽量保存ALP的活性，使实验更加真实、可靠。
故本实验通过对成骨细胞内、外分泌ALP的检测方法进行对比研究。结果证明：成骨细胞细胞内分泌的ALP与细胞外分泌的ALP差异有统计学意义，细胞内分泌的ALP高。在分组时，考虑到细胞在体外生长的周期，即可能的ALP分泌的变化。采用传代后1 d、2 d、3 d，目的是使结果更加可信。并且，实验组与对照组来自同一瓶细胞，排除了不同原代培养细胞对实验结果可能造成的影响。
综上所述，成骨细胞内分泌的ALP比成骨细胞外分泌的ALP高，差异有统计学意义。因此，建议尽量采用将细胞破碎的方法进行ALP含量的检测，以提高结果的准确性。
［1］袁月，哈斯达莱，祝海霆，等.胎鼠成骨细胞原代培养方法研究［J］.中国实用口腔科杂志，2010，3（10）：607-609.
［2］汤新之，崔乃杰.临床生物化学［M］.天津：天津科学技术出版社，1999：107-108.
［3］Sinha P，Kottgen E.Alkaline phosphatase."laboratory and clinical implications［J］.J Chromatogr，1988，42（9）：419-444.
［4］Farley JR，Stilt-Coflfing B.Apoptosis may delermine the release of skeletal alkaline phosphatase activity from human osteoblast—line cel1［J］.Calcif Tissue Int，2001，6868（1）：43.
［5］Nguyen H，QiaIl JJ，Bhamagar RS，et al.Enhanced cell attachment and osteoblastic activity by P-15 peptide-coated matrix in hydrogels［J］.Biochem Biophys Res Commun，2003，311（1）：179.
［6］张学敏，马文辉，时述山，等.正常人成骨细胞主要生物学特性的研究及意义［J］.河北医药，2009，31（7）：798-800.
［7］吴云刚，张志平.人骨髓基质干细胞体外诱导为成骨细胞的实验研究［J］.江西中医学院学报，2007，19（1）：74-75.
［8］朴成吉，蒋青，陈东阳，等.成人成骨细胞骨髓培养法与组织块培养法的对比［J］.中国组织工程研究与临床康复，2007，11（23）：4566-4569.
［9］陈小菊，王嫣，王兰，等.诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的实验研究［J］.重庆医学，2009，38（10）：1185-1187.
