酶法制备乳源ACE抑制肽

于晓庆，王雄，司佳

（1.内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司，内蒙古 呼和浩特 011500；2.湖北工业大学 化学与环境工程学院，湖北 武汉 430068）

血管紧张素转化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）在人体血压调节过程中起重要作用。它催化血管紧张素I从C一端裂解二肽形成血管紧张素II，同时钝化舒缓激肽，造成血压升高。ACE抑制肽对ACE的亲合度比血管紧张素I或舒张激肽要强，而且也不易从ACE结合区释放。从而阻碍ACE催化血管紧张素I水解为血管紧张素II，催化舒缓激肽水解为失活片段，起降血压作用。

牛乳蛋白是人类膳食蛋白质的重要来源，含有包括ACEI在内的多种生物活性序列。乳源ACE抑制肽是当前研究热点，但加工过程中如何选择合适的酶及控制酶解条件以获得大量高活性ACE抑制肽是应用关键。乳源ACE抑制肽以安全性高、无副作用等优点在高血压的防治中具有重要的研究和应用价值，已成为国内外科学家研究的热点。本文利用酶技术从牛乳蛋白中提取ACE抑制肽[1]。

1 材料与分析方法

1.1 材料与试剂

牛乳蛋白：青海雪峰耗牛乳业酪蛋白干酪素生产公司；胰蛋白酶：广州明远工贸有限公司；蛋白酶A：合肥博美生物科技有限责任公司；木瓜蛋白酶：郑州市绿邦科贸有限公司；胃蛋白酶：河南省可以化工有限公司；血管紧张素转化酶（ACE）：长春汇力生物有限公司；马尿酰组氨酰亮氨酸（HHL）：上海亨代劳商贸有限公司。

1.2 实验仪器

XW-80A型旋涡混合器：上海医科大学仪器厂；755S型分光光度计：上海棱光技术有限公司；pHS-4酸度计：上海伟业仪器厂；冷冻干燥机：杭州翔盛气体设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 ACE抑制活性的检测方法

参照Nakamura方法，并作了修改，如反应时间、反应体系的大小、离心时间和速度、乙酸乙酯的萃取量等。

1.3.2 游离氨基酸的测定

取10 mL水解液加入30 mL去二氧化碳蒸馏水，混匀。用酸度计测其pH，用0.1 mol/LNaOH标准溶液滴定至pH8.2，加入甲醛溶液20 mL，1 min后，用0.1 mol/L NaOH标准溶液滴定至pH9.2，记录消耗碱的体积V1（mL）；做空白实验并记录消耗碱的体积V2（mL），则水解物的游离氨基酸浓度（mmol/mL）：

游离氨基酸浓度=M（V1-V2）×1000/10，式中：M为NaOH标准溶液浓度，（mol/L）。

1.3.3 蛋白质水解度（DH）的测定

采用pH-stat法。

1.3.4 乳蛋白源ACE抑制肽的精确制备

称取一定量的牛乳蛋白，于pH7.4的磷酸盐缓冲液溶解。置于恒温水浴锅中，当水浴温度达到水解温度时，加入HCl或NaOH调至预定的pH，然后加入一定量的酶水解。在水解过程中不停地搅拌，并不断加入适当浓度的NaOH以维持pH在规定范围（±0.05）内，记录加碱量和时间。到预定时间后，将反应体系在沸水浴中保温30 min，中止反应。将水解物4000 r/min离心30 min，取沉淀冷冻干燥，然后精确称取一定质量的冻干粉进行ACE抑制活性检测。

1.3.5 半抑制浓度（IC50）的测定

称取一定质量的样品，配制成不同浓度的溶液，测定其ACE抑制活性。以浓度为横坐标，抑制活性为纵坐标绘制曲线，计算IC50值。

2 结果与讨论

2.1 水解用酶的选择

底物质量分数为3%、酶质量分数为3%，分别在各种蛋白酶的最适温度、pH条件下水解牛乳蛋白10 h。反应结束后放在95℃的水浴锅中保温30 min使酶失活，然后离心得上清液。冷冻干燥后进行ACE抑制活性测定，测定结果如表1所示。

表1 酶与抑制活性的关系Table 1 Relationship between enzyme and inhibitory activity

由表1可以看出，4种蛋白酶水解液的ACEI活性有明显差异。蛋白酶A和木瓜蛋白酶水解全乳蛋白产生的ACEI活性较高。胃蛋白酶和胰蛋白酶水解液ACEI活性较低。而空白对照无ACEI活性。对表1中的ACE酶抑制剂进行方差分析可知，胰蛋白酶与蛋白酶A，木瓜蛋白酶，胃蛋白酶之间差异显著。胃蛋白酶与木瓜蛋白酶，蛋白酶A，胰蛋白酶之间差异显著。而蛋白酶A与木瓜蛋白酶差异不显著。木瓜蛋白酶属植物蛋白酶，其酶活力比其它蛋白酶低，水解速度慢。木瓜蛋白酶是以番木瓜未成熟果实的新鲜乳汁为原料，经分离提取制得，价格相对较高，不适于工业化生产。综合考虑，本实验选择蛋白酶A作实验用酶[2]。

2.2 蛋白酶A酶解条件优化

以蛋白酶A作为实验酶，采用四因素三水平的正交试验设计确定最佳的水解条件。由正交试验得出，各因素对ACE抑制活性指标影响的主次顺序：温度>酶用量>pH>底物浓度。最佳反应条件为：温度52℃，酶用量3%，底物质量分数4.5%，pH7。

2.3 水解时间的优化

在一定条件下水解。分别抽取样本，然后进行冷冻干燥，分析ACE抑制活性，见图1。

由图1可知：水解过程中，ACE抑制活性随着水解时间的延长不断升高，当水解时间到9.5 h左右时，ACE抑制活性达到最大值。当继续水解时，ACE抑制活性降低，这是由于水解时间延长，让已生成的ACE抑制肽部分被水解，生成活性较小或没有活性的多肽。

2.4 水解过程中水解度、游离氨基酸含量的变化

水解过程中水解度、游离氨基酸含量的变化见图2、图3。

图1 抑制活性与水解时间的关系Fig.1 Relationship between inhibitory activity and hydrolysis time

图2 水解度与水解时间的关系Fig.2 Relationship betweeen degree of hydrolysis and hydrolysis time

图3 游离氨基酸浓度与水解时间关系Fig.3 Relationship between dissociation amino acid density and hydrolysis time

由图2可知，随着水解时间的增加水解度不断地增大，当水解时间到9.5 h以后，水解度基本不再改变。由图3可知，游离氨基酸浓度随着时间的增长先不断地增大，然后保持稳定，当到达9.5 h以后又开始继续增长。所以水解时间过长，不利于提高ACE抑制活性。

2.5 半抑制浓度的测定

在比较各种食品来源的ACE抑制肽活性强弱时，IC50是最直观的评价指标。以ACE抑制活性为纵坐标、酶解物的浓度为横坐标，绘制酶解物浓度与ACE抑制活性关系曲线，见图4。

图4 抑制活性与酶解物浓度的关系Fig.4 Relationship between inhibitory activity and hydrolysis density

由图4可知，随着酶解液浓度增大，抑制活性增大。但浓度达到某一特定值时，抑制活性保持稳定。根据图4曲线的性质进行二次回归分析，其回归方程为y=-6.9542x2+43.49x+12.691（R＝0.9995），由此推算出酶解液的IC50=1.0263 mg/mL。

3 结论

1）从4种蛋白酶中筛选出能够产生具有较高ACE抑制活性的蛋白酶A，通过正交试验得出最佳反应条件为：pH7、温度52℃、底物质量分数4.5%、酶用量3%。通过单因素试验确定了最适酶解时间为9.5 h。

2）在蛋白酶解反应过程中，随着反应时间的过度延长，水解度略有增加，游离氨基酸含量大幅度增加，此时不利于增加其ACE抑制活性，反而会生成较多的游离氨基酸，不利于ACE抑制肽的生产。

3）乳源蛋白源ACE抑制肽的半抑制浓度为1.0263 mg/mL。

[1]姜瞻梅，霍贵成，吕桂善.不同食物来源的ACE抑制肽的研究现状[J].食品研究与开发，2003，24(1)：27-29

[2]姜瞻梅，田波，吴刚，等.酶解牛乳酪蛋白制备ACE抑制肽的研究[J].中国食品学报，2007，7(6)：39-43

[3]李朝慧，罗永康，王全宇.乳清蛋白酶解制备ACE抑制肽的研究[J].中国乳品工业，2005，33(2)：8-11

[4]管骁，姚惠源.酶法制备燕麦麸蛋白ACE抑制肽的研究[J].食品与机械，2006，22(6)：12-14