应用Solexa技术检测脐血CD34+细胞体外诱导的巨核细胞mRNA表达

王 芳，何 吉，朱发明，刘晋辉，秦 斐，陈 舒，徐 罡，吕行军，严力行

浙江省血液中心 血液安全研究卫生部重点实验室，杭州 310006

·论著·

应用Solexa技术检测脐血CD34+细胞体外诱导的巨核细胞mRNA表达

王 芳，何 吉，朱发明，刘晋辉，秦 斐，陈 舒，徐 罡，吕行军，严力行

浙江省血液中心 血液安全研究卫生部重点实验室，杭州 310006

目的应用Solexa技术研究人脐带血CD34+细胞体外诱导巨核细胞的mRNA表达。方法采用密度梯度离心法和免疫磁珠分选系统获取人脐带血CD34+细胞。100 ng/ml 促血小板生成素诱导培养12 d后，应用抗CD41+单克隆抗体免疫磁珠法分选获得巨核细胞和非巨核细胞。应用Solexa技术检测巨核细胞和非巨核细胞的mRNA表达差异。结果获取的Tag初始数量巨核细胞和非巨核细胞分别为 3 773 147 和 3 533 805 个。整个清晰的Tag数量分别为 3 291 132和 2 967 947 个，明显独特的tag数量分别为 197 769 和 245 318 个。其中上调基因表达数量为1161个，下调为902个。上调Tag表达数量为2717个，下调为1519个。结论巨核细胞和非巨核细胞 mRNA表达存在显著差异，差异基因编码产物与细胞发育、黏附、凋亡、代谢、细胞内及细胞间的信号转导以及免疫应答等功能相关，进一步深入将有助于探讨巨核细胞的表达机制、信号传导及调控机制。

巨核细胞；mRNA表达；体外扩增；Solexa测序

造血干细胞分化成巨核细胞进而产生血小板，涉及到巨核细胞系各期细胞的形成、血小板的入胞和出胞等，是一个复杂的过程，到目前为止其分子机制仍不明确。本研究采用人脐血干细胞体外促血小板生成素(thrombopoietin, TPO)诱导扩增分化为巨核细胞，应用Solexa测序技术检测巨核细胞和非巨核细胞的mRNA表达差异，探讨巨核细胞的表达机制、信号传导及调控机制。

材料和方法

材料脐带血由浙江大学附属妇产医院提供；IMEM培养基、RPMI 1640购自美国Gibco公司； TPO、无血清培养基(Stem SpanTMSFEM)购自加拿大Stem Cell公司；鼠抗人CD41a一抗购自捷克Exbio公司；CD34细胞免疫磁珠分选试剂盒购自德国美天尼公司；羊抗鼠IgG免疫磁珠购自美国DYNAL公司；光学显微镜购自Nikon公司；RNA抽提试剂盒(QIAamp RNA Blood Mini Kit)购自德国Qiagen公司；Solexa测序及软件分析由杭州华大基因研发中心提供。

CD34+细胞的体外分离、纯化、扩增培养和诱导分化脐带血标本与0.9%生理盐水以1∶1充分混匀，形成单细胞悬液层加到比重为1.077 g/ml的淋巴细胞分离液上，离心收集中间的单个核细胞层，用RPMI 1640培养液离心洗涤2次。利用免疫磁珠分选系统，分选CD34+造血祖细胞。将富集的细胞用含100 ng/ml TPO无血清培养基混匀后，1×105/ml接种到培养瓶中，置37℃、5%饱和CO2湿度培养箱中培养12 d，第7天半量换液。

巨核细胞的免疫分离法将培养的细胞按1×106个细胞悬液中加入1 μg鼠抗人CD41a抗体，2～8℃孵育10 min，然后用含0.1%牛血清白蛋白的Buffer(pH 7.4)洗涤，300×g离心8 min，弃去上清，重新悬浮细胞。再加入羊抗鼠免疫磁珠(每1×107个细胞中25 μl)颠倒旋转混匀后2～8℃孵育30 min，每10分钟混匀1次。再将试管放置于磁铁中2 min，收集上清中的非巨核细胞，取去磁铁，用Buffer重悬细胞。重复操作3次。

总RNA提取采用RNA抽提试剂盒，严格按照试剂盒内说明书操作。应用Agilent 2100生物分析仪进行总RNA的质量检验。

Solexa测序将抽提好的RNA用干冰送至华大基因研发中心进行表达谱样品制备、Solexa测序、信息分析。

RT-PCR验证将抽提的巨核细胞和非巨核细胞RNA进行RT-PCR，选择血小板反应蛋白1(thrombospondin-1，THBS1)、同源异形盒基因A9(homeobox A9，HOXA9)进行验证。THBS1终反应体积10 μl，MgCl2终浓度1.5 mmol/L，引物终浓度为0.625 μmol/L，dNTP终浓度为200 μmol/L，Taq DNA聚合酶1.0 U。循环条件：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，63℃退火1 min，72℃延伸30 s，30个循环，最后72℃延伸10 min。产物片断为307 bp。HOXA9终反应体积10 μl，MgCl2终浓度1.5 mmol/L，引物终浓度为0.625 μmol/L，dNTP终浓度为200 μmol/L, Taq DNA聚合酶1.0 U。循环条件：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，60℃退火1 min，72℃延伸30 s，35个循环，最后72℃延伸10 min。产物片断为264 bp。

结 果

总RNA提取结果巨核细胞RNA浓度为30 ng/μl；非巨核细胞RNA浓度为47 ng/μl，RNA纯度合格，无降解。

Solexa技术检测表达谱基本信息Solexa技术检测MK和非MK细胞表达谱的基本情况显示，获取的Tag初始数量MK和非MK细胞分别为 3 773 147和 3 533 805 个，整个清晰的Tag数量分别为 3 291 132 和 2 967 947个，明显独特的Tag数量分别为 197 769 和 245 318 个，未知的Tag数量分别为4496和4204个，分别占清晰Tag的2.27%和1.71%。

基因在MK和非MK间表达的相关性基因在MK和非MK间表达存在一定的相关性，其中MK和非MK间基因的Spearman 等级相关系数为0.898，Pearson相关系数为0.6，根据散点分布的集中性和轴向性，可以判断实验的重复性较好。

差异表达基因分析结果采用Solexa技术检测，以假发现率≤0.001，探针的相对富集强度|log2Ratio|≥1作为判断基因表达差异显著的阈值。其中基因表达数量上调为1161个，下调数量为902个。Tag表达量上调为2717个，下调为1519个。差异基因功能分类主要有局部黏附、干细胞谱系、细胞外基质-受体相互作用、DNA复制转录、凋亡、肿瘤发生、细胞周期发育、新陈代谢、白细胞跨膜迁移、信号转导、细胞黏附分子、细胞骨架、免疫应答13类。

RT-PCR验证结果THBS1在巨核细胞表达高于非巨核细胞，THBS1的相对富集强度 log2Ratio (MK/非MK)=2.645 997；HOXA9在巨核细胞表达低于非巨核细胞，HOXA9的相对富集强度 log2Ratio (MK/非MK)=-10.4315(图1)。

讨 论

Solexa技术是一种大规模高通量的测序分析技术[1-4]，它利用单分子阵列测序，此种测序法利用边合成边测序的原理，在每个循环过程里，将4种荧光标记的核苷和聚合酶加入到单分子阵列中，利用生物发光蛋白，通过碱基加到引物后端时所释放出的焦磷酸盐来提供检测信号，荧光信号被图像传感器采集，图像传感器快速扫描整个阵列检测特定的结合到每个片断上的碱基。通过上述的结合，检测可以重复几十个循环，这样就有可能决定核苷酸片断中的几十个碱基。

Solexa表达谱分析技术是基于新一代测序技术的全基因组表达谱分析方法，该方法首先从每个mRNA的3’端酶切得到一段21bp的Tag片段(特异性标记该基因),然后通过高通量测序，得到大量的Tag序列，不同的Tag序列的数量就代表了相应基因的表达量；通过生物信息学分析得到Tag代表的基因、基因表达水平以及样品间基因表达差异等信息[5-8]。与传统的基因芯片技术比较，利用高通量测序进行表达谱研究的优势很明显，Solexa表达谱分析技术可直接测定每个基因的特异性表达标签序列，通过计数表达标签序列的数目来确定该基因的表达量，大大提高了定量分析的准确度。整体表达差异分布符合正态分布，不会因为不同批次实验引起不必要的误差。Solexa表达谱分析技术可重复性高，不同批次的表达谱度量准确，能够更准确地进行表达差异分析；灵敏度高，对于表达差异不大的基因能够灵敏的检测其表达差异；性价比高；由于该技术不用事先设计探针，而是直接测序的方式，因此无需了解物种基因信息，可以直接对任何物种进行包括未知基因在内的全基因组表达谱分析，因此性价比很高。高通量测序，已有数据表明，当测序通量达到200万个表达标签时，即可得到样本中接近全部表达基因的表达量数据，而目前每个样本分析可以得到300万～600万个表达标签，可同时发现新的转录本、基因组表达调控区域等[5-6]。因此，目前Solexa表达谱分析技术已逐步取代基因表达系列分析和传统的基因表达谱技术。

近年发现造血干细胞体外扩增的巨核细胞输注到患者体内后，能加速患者血小板的恢复，缩短血小板缺乏期，这为化疗或移植后的血小板减少症提供一个潜在的新的治疗途径。本研究采用Solexa表达谱分析技术分析人脐带血造血干细胞分化的巨核细胞mRNA表达谱，分别获取了MK和非MK细胞 3 773 147和 3 533 805个初始Tag，整个清晰的Tag数量分别为 3 291 132和 2 967 947个，明显独特的tag数量分别为 197 769和 245 318个。同时表达谱显示约有2%的tag属于未知的序列，提示Solexa表达谱分析技术更易发现新的转录组。本研究发现1661个上调、902个下调基因和2717个上调、1519个下调标签，这些差异基因编码产物与细胞发育、黏附、凋亡、代谢、细胞内及细胞间的信号转导以及免疫应答等功能相关，主要有局部黏附、干细胞谱系、细胞外基质-受体相互作用、DNA复制转录、凋亡、肿瘤发生、细胞周期发育、新陈代谢、白细胞跨膜迁移、信号转导、细胞黏附分子、细胞骨架、免疫应答等13类。与非MK细胞相比，MK细胞中ZNF576、IRX3显著上调，其在转录调控中发挥重要作用，而CD34等干细胞特异性表面抗原显著下调，THBS1、SELP、CD61、VWF、GP5等与MK细胞分化相关的基因显著上调，这些基因涉及细胞与基质及细胞间黏附、细胞周期及发育、细胞骨架形成及调控等功能，CCR4等趋化因子及受体、IL6ST和CSF3R等参与免疫反应及其调控，同时还有大量新陈代谢及信号转导相关基因明显差异表达，另外，IRAK2、CAPN2等凋亡相关基因在MK细胞中表达丰度高于非MK细胞，而BCL2、TNFRSF10D等抑制凋亡的基因表达丰度则低于非MK，表明TPO诱导的凋亡与巨核细胞分化相关，这与Ryu等[9]的结果一致。本研究在差异表达的基因中选择了log2Ratio (MK/非MK)为2.6的THBS1和log2Ratio (MK/非MK)为-10.4的HOXA9进行验证。THBS1在调节细胞的黏附、移行、增生和分化、诱导血小板聚集和抑制血管生成方面发挥重要作用，在巨核细胞中表达高于非巨核细胞；HOXA9存在于早期造血干/祖细胞，参与造血干/祖细胞分化的调控；在巨核细胞中表达低于非巨核细胞。

M:Marker;1:巨核细胞；2：非巨核细胞M :Marker; 1: megakaryocyte; 2: non-megakaryocyte

Solexa测序发现的潜在调控基因以及未知序列今后仍需要进一步深入的研究，以阐明转录本增强或降低对巨核细胞增殖和分化过程的影响。

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AnalysisofmRNAExpressionProfilesofMegakaryocytesfromHumanCordBloodCD34+CellsExVivoExpandedUsingSolexaSequencing

WANG Fang, HE Ji, ZHU Fa-ming, LIU Jin-hui, QIN Fei,CHEN Shu, XU Gang, LÜ Xing-jun, YAN Li-xing

Blood Center of Zhejiang Province, Key Laboratory of Blood Safety Research, Ministry of Health, Hangzhou 310006, China

YAN Li-xing Tel: 0571-85167801, E-mail: ylx@zjb.org.cn

ObjectiveTo investigate the mRNA expression profiles of megakaryocytes (MKs) from human cord blood CD34+cellsexvivoexpanded using Solexa technique.MethodsCD34+Cells were isolated using density gradient centrifugation and magnetic activated cell sorting. Cultures were stimulated with recombinant human thrombopoietin (100 ng/ml). After 12 days, the MKs fraction was separated from the non-MKs fraction using an anti-CD41 monoclonal antibody by immunomagnetic sorting. The mRNA expression of MKs and non-MKs was detected by Solexa sequencing.ResultsWe obtained 3 773 147 and 3 533 805 Tags from MKs and non-MKs, respectively. The amounts of unambiguous tags were 3 291 132 and 2 967 947 and those of distinct tags were 197 769 and 245 318. The expression of 1161 genes was up-regulated and that of 902 genes down-regulated. The expression of 2717 tags was up-regulated and that of 1519 tags down-regulated.ConclusionsMKs and non-MKs have remarkably different mRNA expression profiles. The differential gene-encoded products may be involved in cellular development, adhesion, apoptosis metabolism, intra- and inter-cellular signal transduction, and immune response. Further studies on this topic may clarify the expression mechanism, signal transduction, and regulation mechanisms.

megakaryocyte; mRNA expression;exvivoexpansion; Solexa sequencing

ActaAcadMedSin, 2011,33(5):529-532

严力行 电话：0571-85167801，电子邮件：ylx@zjb.org.cn

R392.12

A

1000-503X(2011)05-0529-04

10.3881/j.issn.1000-503X.2011.05.010

2010-10-29)