利用纳豆菌和乳酸菌共同发酵奶液的研究

黎婉园，夏枫耿，陈中，张素娟

1(广州市微生物研究所，广东广州510250)

2(华南理工大学轻工与食品学院，广东广州，510641)

3(安心生物制品有限公司，广东广州，510240)

利用纳豆菌和乳酸菌共同发酵奶液的研究

黎婉园1，2，夏枫耿1，陈中2，张素娟3

1(广州市微生物研究所，广东广州510250)

2(华南理工大学轻工与食品学院，广东广州，510641)

3(安心生物制品有限公司，广东广州，510240)

利用纳豆菌和乳酸菌共同发酵奶液，对发酵过程中发酵乳的外观、口感、酸度、微生物数量以及纳豆激酶酶活力的变化进行了研究。结果表明:接种纳豆菌8h后再接种乳酸菌进行发酵的样品，在外观、口感、乳酸菌以及纳豆激酶酶活力方面都有效好效果。

纳豆菌，乳酸菌，纳豆激酶，发酵奶液

乳酸菌饮品是以牛乳、羊乳为原料，以乳酸菌作为发酵剂，经过发酵而成的具有独特口感和风味的乳饮品，乳酸菌是一些中温菌［1］，包括保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌、乳酸链球菌、双歧杆菌、嗜热链球菌，乳酸菌对乳类进行发酵后，乳类中的乳糖最终被分解产生乳酸，蛋白质分解为多肽和氨基酸，有利于人体对乳糖和蛋白质的吸收和利用。纳豆激酶(Nattokinase，NK)是由纳豆菌产生，纳豆菌是好氧的革兰氏阳性菌，芽孢杆菌属，枯草芽孢杆菌的一个亚种［2］。近年来研究表明纳豆菌发酵产生的纳豆激酶是一种具有强烈溶栓功能的蛋白酶、其酰胺水解活性、纤溶活性及溶栓作用已经被证实，同时纳豆激酶的抗肿瘤、降血压、抗菌、预防骨质疏松、抗氧化、调节肠功能等作用也备受关注［3］。

目前市售的乳酸饮品主要分为单一型和混合型两大类，单一发酵类型的是由乳酸菌和乳类发酵而成，混合型是在单一发酵的基础上添加谷物、果粒、蔬菜等，本文研究利用纳豆菌和乳酸菌协同发酵奶液，对不同的发酵配方进行包括pH值、乳酸菌数量、纳豆菌数量、纳豆激酶酶活力变化的跟踪研究。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌种

纳豆菌、乳酸链球菌、保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌、双歧杆菌、嗜热链球菌由广东省种质资源库广州市微生物研究所分库提供。

1.1.2 培养基、试剂

纤维蛋白原、凝血酶、尿激酶、牛血清白蛋白为标准试剂，购自中国药品生物制定检定所。

营养肉汤，MRS液体培养基，购自广东环凯微生物科技有限公司。

1.1.3 发酵奶液配方

奶粉10%，砂糖5%，葡萄糖1%，水。

1.2 方法

1.2.1 纳豆菌种子液制备

保存的纳豆杆菌菌种由斜面接种到装有100 mL营养肉汤中，35℃下，180 r/min摇床培养16 h，制得纳豆菌种子液［4］。

1.2.2 乳酸菌种子液的制备

保存的乳酸链球菌、保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌、双歧杆菌、嗜热链球菌，分别由斜面接种到100 mL的MRS培养基中，放在35℃培养箱中培养16 h，制得乳酸菌种子液。

1.2.3 发酵牛奶的方法

把经摇床培养的纳豆菌和乳酸菌种子液按照1%的接种量于不同的时间接种到已经配制好的牛奶液中，放在35℃培养箱中培养 2，4，6，8，10，12，14，16，18 h进行各项指标的测定。

1.2.4 酸度的测定方法［5］

参照GB/T5009.46乳与乳制品卫生标准的分析方法。

1.2.5 菌落计数方法［6－7］

纳豆菌数量依照GB/T 4789.2食品微生物检验菌落总数测定，乳酸菌数量依照GB/T 4789.35测定。

1.2.6 纳豆激酶活力的测定［8］

纤维蛋白平板法，参照并改良Astrup法制备双层纤维蛋白平板，下层为2.5%的琼脂。上层为一支纤维蛋白原先溶于3 mL、37℃无菌水中，再溶于20 mL已灭菌的巴比妥纳缓冲液中;另取0.6 g琼脂糖溶于40 mL巴比妥纳缓冲液中灭菌冷却至60℃，二者迅速混匀，加入人凝血酶300 μL(20 U/mL)，摇匀倒入4个Φ9 mm已凝固的琼脂平板上层，静置1 h，用3 mm打孔器打孔。将尿激酶标准品(20、40、60、80、100、120、140、160 U/mL)各7 μL点样于新配制的纤维蛋白平板上，放置10 min，移入37℃培养箱，保温17 h后取出。测定溶栓圈的垂直直径，并以垂直直径乘积(cm2)为横坐标，以尿激酶浓度(U/mL)为纵坐标作图，得标准曲线Y=aX+b。

测定时取纳豆激酶样品用巴比妥纳缓冲液稀释至适当浓度，取7 μL点样于纤维蛋白平板上，并以80 U/mL尿激酶作为标准对照，测量其形成透明圈2条相互垂直的直径，并计算其面积。据标准曲线计算样品活力Y值(U/mL)。其中样品的X值=样品溶栓圈直径乘积(cm2)/校正系数f;f=样品平板尿激酶对照溶栓圈直径乘积(cm2)/标准曲线中相对应的尿激酶溶栓圈直径乘积(cm2)。

2 结果与讨论

在不同的时间加入乳酸菌和纳豆菌有5种组合，同时设立乳酸菌和纳豆菌阳性对照组共7组进行试验，每组平衡10个样品，见表1。

表1 试验分组

对实验设计的7个试验组进行各项指标的测定。

2.1 发酵时间对外观、口感的影响

表2 色泽、口感的变化

分析表2可以看出，利用乳酸菌对奶类进行发酵，会使蛋白质变性，出现凝固的现象，有酸甜的口感，利用纳豆菌对奶液发酵也会出现凝固的现象，但酸甜度没有明显的变化，第1组同时接种纳豆菌和乳酸菌，发酵速度较快，液体和固体分层现象出现得比较早，从外观和口感上与第6组单独使用乳酸菌发酵的结果比较接近;第7组单独使用纳豆菌进行发酵时，外观上看与乳酸菌发酵的没有区别，但液体凝固时间较晚而且没有酸甜的口感，酸味基本没有。分析第2，3，4，5组发现，先接种纳豆菌发酵，随后在不同的时间接种乳酸菌，随着乳酸菌接种时间的推迟，发酵时间也相应地加长，液体和固体分层的现象也相应地推迟，同时接种乳酸菌和纳豆菌，由于乳酸菌生长速度较快，会抑制纳豆菌的生长。

2.2 酸度的变化

分析图1看出，样品的酸度随着发酵时间的延长，酸度不断增加，第7组单独使用纳豆菌进行奶液发酵时，酸度没有明显的增加，从第3，4，5组可以看出，加入乳酸菌后，酸度明显增加，乳酸菌是发酵中主要的产酸菌种，加入时间的推迟，酸度的升高也相应推迟，要到达相同的酸度，发酵时间要加长。

图1 酸度变化曲线

2.3 乳酸菌和纳豆菌菌落总数的测定

表3 乳酸菌和纳豆菌菌落总数的变化 CFU/mL

分析表3可以看出，第1组，当乳酸菌和纳豆菌同时加入时，由于乳酸菌的生长迅速，成为优势菌落，产酸、耗氧以及消耗掉大部分的营养物质，使纳豆菌无法生长。当乳酸菌延迟加入时，发现纳豆菌可以生长，但纳豆菌生长速度较乳酸菌缓慢而且纳豆菌是好氧菌，纳豆菌和乳酸菌都能够较好生长的是第5组，当纳豆菌发酵8 h后才加入乳酸菌，一起发酵到16 h，对此组样品进行纳豆菌和乳酸菌计数时发现，两种菌都能有较好的生长，都能得到比较高的菌落数。

2.4 发酵时间对酶活力的影响

2.4.1 尿激酶标准曲线(图3)

图3 尿激酶标准曲线

2.4.2 纳豆激酶酶活力的变化

从表3可知，在发酵早期(0～6 h)，纳豆菌数量没有明显的增长，所以测试纳豆激酶的酶活力从8 h开始。

分析表4数据可以看出，推迟乳酸菌接种迟，有利于纳豆菌的生长，同时随着发酵时间的延长，纳豆激酶的酶活力也在增加，16 h进入生长的高峰期，一直持续到18 h。根据表4的数据可得出图4。

表4 纳豆激酶酶活力的变化

图4 纳豆激酶活力曲线

3 结论

试验主要研究利用乳酸菌和纳豆菌共同对奶液进行发酵，分别对乳酸菌和纳豆菌按照不同时间接种而形成的不同组别进行的各项指标检测并分析结果。试验表明单独接种纳豆菌对奶液发酵，纳豆菌在奶液中能很好生长，并使奶液凝固，产生较高的纳豆激酶酶活力，但没有酸甜的口感。利用纳豆菌和乳酸菌共同发酵奶液，根据不同菌种不同的接种时间有不同的结果出现，如先接种乳酸菌，由于乳酸菌繁殖较快，会成为优势菌种并且产酸抑制纳豆菌的生长，如先接种纳豆菌，让纳豆菌在奶液中生长到8 h再接种乳酸菌，则能够让纳豆菌较好生长产生一定的纳豆激酶，同时又能使后接种的乳酸菌正常生长，产生酸甜口感。纳豆菌弥补了乳酸菌发酵乳功能上的不足，乳酸菌则改善了纳豆菌发酵奶液不产酸而导致的口感上的不佳。利用纳豆菌和乳酸菌共同发酵奶液，得到营养功能、营养成分更符合人们需要的产品。

［1］ 杨郁，张丽靖 纳豆菌和乳酸菌的耐酸性比较研究［J］．食品研究与开发，2008(3):78－80．

［2］ Martin M，Kouhei M．Natto and its active ingredient nattokinase a potent and safe thrombolytic agent［J］．Alternative ＆ Complementary Therapies，2002(6):157 －164．

［3］ Zheng Z L，Zuo Z Y，Liu Z G，et al．Construction of a 3D model of nattokinase，a novel fibrinolytic enzyme from Bacillus natto．a novel nucleophilic catalytic mechanism fornattokinase［J］．Journal of Molecular Graphics and Modelling，2005，23:373 －380．

［4］ 明飞平，赵培静，纳豆芽孢杆菌液体发酵条件的优化研究［J］．现代食品科技，2009，25(6):625 －628．

［5］ GB/T5009．46．乳与乳制品卫生标准的分析方法［S］．

［6］ GB/T4789．2．食品微生物检测菌落总数测定［S］．

［7］ GB/T4789．35．食品微生物检验 乳酸菌检验［S］．

［8］ 杨明，董超．纤维蛋白平板法测定纳豆激酶方法的改进［J］．中国酿造 2008(7):77 －80．

［9］ 丁有学，刘兰，袁力勇．纳豆激酶的研究进展［J］．中国生物制品学杂志，2008(12):1 129－1 131．

［10］ 王聪，孔繁东，祖国仁．纳豆激酶的研究现状与展望［J］．食品研究开发，2004，25(6):17 －20．

［11］ 梁淑娃，黄晓曼，夏枫耿，等．纳豆激酶液体深层发酵技术的研究［J］．现代食品科技，2007，23(6):1 －3．

Research About Fermentation Milk with Bacillus natto and Lactobacillus

Li Wan-yuan1，2，Xia Feng-geng1，Chen Zhong2，Zhang Su-juan3
1(Guangzhou Microbe Research Institute，Guangzhou 510250，China)
2(School of Light Industry and Food Science，South China University of Technology，Guangzhou 510641，China)
3(Guangzhou Anxin Biological Products Co．，Ltd．，Guangzhou 510240，China)

This research was about fermentation milk with Bacillus natto and lactobacillus，studied the changes of color and texture，acidity，microbial counts and Nattokinase during the fermentation．The result showed that the sample that was fermented with Bacillus natto fermentation 8 h before lactobacillus is the best．

Bacillus natto，Lactobacillus，Nattokinase，fermentation milk

硕士，高级实验师。

*广州市重大科技专项计划项目(2009A1－E021－5):酶制剂的大规模制备。

2011－03－28，改回日期:2011－07－12