黏度法测定γ-聚谷氨酸含量*

姚俊，孙荣斌，魏钦俊，曹新，鲁雅洁

1(南京医科大学基础医学院，生物技术系，江苏南京，210029) 2(南京医科大学 药学院，江苏 南京，210029)

黏度法测定γ-聚谷氨酸含量*

姚俊1，孙荣斌2，魏钦俊1，曹新1，鲁雅洁1

1(南京医科大学基础医学院，生物技术系，江苏南京，210029) 2(南京医科大学 药学院，江苏 南京，210029)

采用乌氏黏度计测定了不同浓度下γ-聚谷氨酸稀溶液的黏度，由哈金斯(Huggins)方程和克拉默(Kraemer)方程结合外推法求得室温下γ-聚谷氨酸在中性水溶液中的特性黏度［η］为7.830 L/g，并推导出由溶液的相对黏度ηr与增比黏度ηsp计算γ-聚谷氨酸溶液浓度的公式。依据溶液黏度与浓度的关系，可以简便、快速、准确地估算出γ-聚谷氨酸的浓度。

γ-聚谷氨酸，黏度，浓度

γ-聚谷氨酸(γ-polyglutamic acid，简称 γ-PGA)是一种由微生物发酵合成的生物高分子，由于γ-PGA水溶性好、吸水性强、可生物降解并具有良好的生物相容性，是不可降解的合成高分子材料(如塑料和水凝胶等)强有力的替代品，在工农业、食品与医药等领域极具应用潜力［1－3］。在γ-PGA的合成与应用研究中，如何进行γ-PGA的定量是一项十分重要的基础工作，目前，文献中报道的γ-PGA含量测定方法多采用凝胶渗透色谱法(GPC)［1－2］，但仪器成本昂贵，测定过程繁琐，因而在实际应用中受到局限。本研究采用乌氏黏度计测定了γ-PGA稀溶液的黏度，同时关联了γ-PGA稀溶液黏度与浓度的关系，可作为简便、有效的替代方法进行γ-PGA含量的测定，可为γ-聚谷氨酸的生产实践和应用研究带来极大便利。

1 材料和方法

1.1 实验仪器

凝胶渗透色谱仪(Alltech)，Shodex OHpak SB-806M HQ色谱柱，Thermo LINEAR UV 201紫外检测器，SFD RI2000示差折光检测器，乌氏黏度计(毛细管直径0.4～0.5 mm，上海精密仪器仪表有限公司);秒表(分度0.1 s)。

1.2 γ-PGA的制备

1.2.1 菌株

γ-PGA合成菌 Bacillus subtilis PGS-1，本实验室自主筛选。

1.2.2 培养基和培养方法

种子培养基(g/L):葡萄糖 20，酵母膏 5，K2HPO4·3H2O 2，MgSO40.25，谷氨酸钠 10，pH 7.0。

发酵培养基(g/L):葡萄糖 40，谷氨酸钠 40，其余同种子培养基。

培养方法:32.5℃，220 r/min，种子培养基培养15 h后按1%接种量接于发酵培养基中培养48h。

1.2.3 γ-PGA的分离纯化

Bacillus subtilis PGS-1分批发酵获得含γ-PGA的发酵液，经预处理和分离纯化后得γ-PGA纯品，具体方法参见文献［4］。经GPC检测纯度达95%，分子质量500 ku，可做为标准品用以配置不同浓度的γ-PGA稀溶液。

1.3 分析方法

1.3.1 GPC法测定γ-PGA含量与分子质量

参见文献［5－6］。

1.3.2 γ-PGA稀溶液黏度的测定

称取一定量的纯品γ-PGA配置成一定浓度梯度的水溶液(pH值7.0)，室温下采用乌氏黏度计测定γ-PGA溶液和纯溶剂(水)的流出时间，分别计算γ-PGA溶液的相对黏度 ηr、增比黏度 ηsp和特征黏度［η］。

1.3.3 γ-PGA发酵液相对黏度的测定

按1.2.2培养方法获得的含γ-PGA发酵液pH为中性，呈黏稠糖浆状，稀释一定倍数后，过0.65 μm滤膜除菌，同时取滤液按1.3.1和1.3.2方法进行GPC测定和相对黏度ηr的测定。

1.3.4 γ-PGA稀溶液黏度与浓度关系的推导与计算

称取一定量的纯品γ-PGA配置成一定浓度梯度的水溶液，室温下采用乌氏黏度计测定γ-PGA溶液和纯溶剂(水)的流出时间，分别计算γ-PGA溶液的相对黏度(ηr)、增比黏度(ηsp)和特征黏度(［η］)。

ηr:相对黏度，ηr= η/η0，溶液黏度对溶剂黏度的相对值。其中η0为纯溶剂黏度，反映了溶剂分子间的内摩擦;η为溶液黏度，反映了溶剂分子与溶剂分子之间、高分子与高分子之间和高分子与溶剂分子之间三者内摩擦的综合表现。当溶质浓度c＜10 g/L时，ηr=t/ts，其中t、ts分别为用乌氏黏度计测定的聚合物溶液和纯溶剂(水)的流出时间，单位是秒(s)。

ηsp:增比黏度，ηsp=(η －η0)/η0=(η/η0) －1=ηr－1=(t－ts)/ts，反映了高分子与高分子之间，纯溶剂与高分子之间的内摩擦效应。

在一定温度下，聚合物溶液的黏度与浓度有一定的依赖关系。描述溶液黏度与浓度关系的方程式很多，应用较多的有:哈金斯(Huggins)方程和克拉默(Kraemer)方程［7－8］:

其中［η］为特性黏度，反映了高分子与溶剂分子之间的内摩擦效应，其值与浓度无关。k为哈金斯常数，β为克拉默常数。k和β表示了溶液中高分子间和高分子与溶剂分子间的相互作用，对分子质量不敏感。采用“外推法”可得到共同的截距［η］、以及斜率k和－β值。

由哈金斯方程和哈金斯方程推导可得公式(3)。将“外推法”计算得到的［η］、斜率k和－β值带入公式(3)，可得计算溶液浓度C的公式(3)。

2 结果与讨论

2.1 相对黏度(ηr)、增比黏度(ηsp)和特征黏度(［η］)的测定

称取定量γ-PGA纯品配置成10 g/L溶液，分别稀释为不同浓度的γ-PGA溶液，室温下采用乌氏黏度计测定各稀释液的流出时间t。分别计算各溶液的相对黏度(ηr)、增比黏度(ηsp)，如表1所示。

表1 不同浓度γ－PGA溶液的黏度测定结果

根据表1数据，按1.3.4所述方法，对ηsp/c－c与lnηr/c－c进行作图和线性拟合，如图1所示。采用乌氏黏度计测定并计算γ-PGA的特性黏度［η］时，需要配制浓度适宜的供试溶液。供试溶液浓度过高，则流出时间过长，影响样品测定的效率;浓度过低，则流出时间过短，不同浓度供试溶液的流出时间无明显差别，所作直线相关性较差，影响测定的准确性。实验结果表明稀释倍数大于75，供试溶液 ηr值在1.4 ～2.5，浓度 c与 lnηr/c、ηsp/c间有较好的相关关系(相关系数大于0.98)，2条直线基本汇合于一点，说明实验数据的可靠性较高。

根据拟合结果:［η］=(7.871+7.789)/2=7.830 L/g，k=20.670，β =8.787，带入公式(3)得估算γ-PGA稀溶液浓度的公式(4):

图1 γ-PGA水溶液黏度与浓度的关系

公式(4)适合于快速测定γ-PGA稀溶液的浓度，只需测定一个浓度下的γ-PGA稀溶液的相对黏度ηr，即可简便、快速并准确测出 γ-PGA稀溶液的浓度。

需要说明的是，对于不同菌株合成的γ-PGA分子量存在差异［1－2］，因此，特征黏度［η］以及参数 k、β的值会有不同，但其推导和计算仍可参照以上方法，先采用外推法获得［η］以及参数k、β的值，再代入公式(3)，即可获得浓度C的计算公式。

2.2 发酵液γ-PGA含量的测定

根据GPC的检测结果发现，在γ-PGA合成旺盛的对数生长期后期与稳定期，Bacillus subtilis PGS-1合成的γ-PGA分子质量基本维持不变(500Ku)，此外，发酵体系的pH基本维持在中性，因而发酵体系黏度的增加基本源于γ-PGA在胞外的积累。因此，可采用黏度法来估算发酵液γ-PGA含量。取培养48 h的发酵液稀释不同倍数，分别采用黏度法与GPC法进行γ-PGA含量的测定。

表2 发酵液γ-PGA含量测定结果

实验结果表明(表2)，不同稀释倍数下，GPC法测得的结果变化不大(c＇GPC均值=16.96 g/L)，与之相比，黏度法的测定结果则出现了一定偏差。稀释倍数＜200时，黏度法测定的结果偏差较大;随稀释倍数的增加，偏差逐渐减小;当稀释倍数≥200，发酵稀释液的相对黏度在1.5～2.0之间时，黏度法测得的发酵液γ-PGA含量与GPC测定结果基本接近。出现这一结果可能是由于发酵液成分较为复杂，除γ-PGA外还含有大量无机和有机小分子的电解质，会影响溶液中γ-PGA的悬浮状态，稀释倍数较低时，溶液中γ-PGA分子趋于聚集，因而以γ-PGA标准稀溶液的黏度测定作为依据的估算结果出现了较大偏差;但随稀释倍数的增加，电解质的影响减弱，γ-PGA分子趋于分散，溶液性质趋于均一，因而黏度法测得结果的偏差逐渐减小。

3 小结

与GPC法相比，黏度法测定γ-PGA含量仅需乌氏黏度计、计时器等常规仪器即可进行γ-PGA的定量，方法简便，适用性强，在仪器设备条件有限的情况下，黏度法可作为有效的替代方法进行γ-PGA的定量，为γ-PGA的生产实践及其应用研究提供指导。此外，γ-PGA含量的黏度法测定还为其他水溶性大分子的定量方法提供了借鉴。

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Determination of γ-polyglutamic Acid Concentration by a Viscosity-assaying Method

Yao Jun1，Sun Rong-bin2，Wei Qin-jun1，Cao Xin1，Lu Ya-jie1
1(Department of Biotechnology，School of Basic Medical Science，Nanjing Medical University，Nanjing 210029，China)2(School of Pharmacy，Nanjing Medical University，Nanjing 210029，China)

ABSTRACTThe viscosity of γ-polyglutamic acid(γ-PGA)solution at different concentration was determined by ubbelohde viscometer.The intrinsic viscosity ［η］of γ-PGA was 7.830 L/g calculated from Huggins ＆Kraemer equation.Meanwhile，the correlation of relative viscosity(ηr)，specific viscosity(ηsp)and the γ-PGA concentration in aqueous solution was deduced.It was expected that the γ-PGA concentration could be facilely and precisely attained by the viscosity-assaying method.

γ-polyglutamic acid，viscosity，concentration

讲师(孙荣斌实验师为通讯作者，Email:biotechnol@yeah.net)。

*江苏省高校自然科学研究项目(09KJB530007)。

2010－08－10，改回日期:2010－09－30