超声辅助脂肪酶催化合成富含n－3多不饱和脂肪酸磷脂的研究

詹忠根

超声辅助脂肪酶催化合成富含n－3多不饱和脂肪酸磷脂的研究

詹忠根

(浙江经贸职业技术学院，杭州 310018)

以脂肪酶Lipozyme TL IM为催化剂，研究了合成富含n－3多不饱和脂肪酸磷脂的最佳工艺条件，即以正庚烷∶异辛烷∶正已烷=8∶1∶1为超声介质，溶剂(mL)/底物(g)=2，酶用量为25%，超声介质中水分质量分数为2%，超声功率70 W，55℃下连续超声5．5 h，在此条件下酯交换到磷脂上的DHA和EPA总质量分数为22．99%。由此可见，通过超声辅助及酯交换条件的优化，不仅可以大大缩短反应所需的时间，而且也能充分激活Lipozyme TL IM的酶活力，从而提高酯化反应的效率。

超声辅助 脂肪酶 n－3多不饱和脂肪酸

n－3多不饱和脂肪酸二十二碳六烯酸(DHA)与二十碳五烯酸(EPA)具有促进胎儿发育、提高儿童智商、预防心血管疾病、降血脂、延缓衰老、预防老年性痴呆、防止癌症等生理功能。而卵磷脂是一种优良的乳化剂，可作为血管的清道夫;具有健脑养脑、保护肝脏;可作为糖尿病、胆结石患者的营养品;能消除青春痘、雀斑、滋养皮肤;预防老年痴呆等。由于DHA和EPA在磷脂分子中比在三酰甘油分子中更利于人体消化吸收，生理活性更强，且比它作为脂肪酸或其甲、乙酯及甘油酯形式稳定性增强，不易被氧化，在食品、化妆品、药品中有广泛的用途。此前，潘丽等［1］、金华丽等［2］在正已烷反应体系中，以脂肪酶Novozym 435为催化剂，探讨了大豆粉末磷脂与DHA、EPA酯交换反应的最佳工艺条件。但由于该研究所使用的脂肪酶Novozym 435的价格偏高、反应时间过长等不足，因此急需探寻低成本、高效率的合成体系，为工业化生产提供技术依据。

1 材料与方法

1．1 材料与设备

大豆卵磷脂:质量分数≥99%，氮化合物(以N计):0．9 ±0．3，磷化合物(以 P 计):2．3 ±0．3;Lipozyme TL IM(Thermomyces lanuginosis脂肪酶):丹麦Novo公司;鱼油:无锡市迅达海洋生物制品厂，含量DHA 70%、EPA 10%，平均密度0．94 g/mL;其他试剂均为分析纯。

7890A GC/MS:美国 Agilent公司;KQ－500DB超声波发生器:昆山市超声仪器有限公司。

1．2 试验方法

1．2．1 富含n－3多不饱和脂肪酸DHA/EPA磷脂制备与检测

合成:在50 mL的锥形瓶中，加入一定量卵磷脂、鱼油、溶剂、脂肪酶Lipozyme TL IM，放在超声频率为40 kHz的超声发生器中，在一定功率下定温反应一段时间后进行纯化。

纯化［1］:待酯化反应结束后低速离心(3 500～4 000 r/min)，回收固定化酶，离心两次，以便最大限度除去酶。然后混合液在50℃旋转蒸发，除去溶剂。再将此混合物置于100 mL烧杯中，每次加入8～10 mL冷丙酮(0℃)洗涤，用自动搅拌仪搅拌10 min后进行离心(3 500～4 000 r/min)，以洗脱游离的脂肪酸，直至取少量上清液于洁净的玻璃片上，快速挥干后无油渍为止，所得固形物经真空干燥(50℃)后即得粉末结构化磷脂，并保存于－20℃。

甲酯化［3］:称取结构化磷脂50 mg加1%硫酸－甲醇2 mL于70℃水浴加热30 min，加入正已烷2 mL，再加蒸馏水至瓶颈，取出上清液，再用1 mL正已烷洗1次，合并上清液(注意要加NaOH中和到pH=7)，放入小瓶中待测。

气相色谱检测条件:温箱温度140℃，保持2 min，然后按6℃/min升温至170℃，保持1 min，再以3．5 ℃/min升温至240 ℃，保持12．5 min，最后以12℃/min升温至260℃，保持2 min。进样口温度250℃，载气氦气流速1 mL/min，不分流进样。检测器:氢火焰离子化检测器(FID)。毛细管色谱柱:DB －5ms UI 30 m ×0．25 mm，膜厚0．25 μm。

1．2．2 超声介质对反应的影响

超声介质的种类对反应的影响:在50 mL的锥形瓶中，加入卵磷脂 1．000 0 g，鱼油 2．10 mL(合2．00 g)，脂肪酶 Lipozyme TL IM 0．600 0 g(加水量为脂肪酶质量的1%)，分别以异辛烷、正庚烷、正已烷为超声介质，45℃、超声功率60 W下辐照3．5 h，通过测定产物中DHA－EPA的含量确定最适溶剂。

不同超声介质复配对反应的影响:以选择出的最适超声介质为主溶剂，另两种为助溶剂(其他条件不变)，考察不同溶剂比例的变化对反应的影响，从中筛选出一种最具效率而毒性较小的反应溶剂。

超声介质添加量对反应的影响:以筛选出的最佳超声介质复配比例混合溶剂，并以混合溶剂(mL)与底物(g)之比分别为 0．5、1．0、1．5、2．0、2．5、3．0、3．5的比例进行试验(其他条件不变)，以确定最适超声介质添加量。

1．2．3 连续超声时间对反应的影响

在最适超声介质中设定 1．5、2．5、3．5、4．5、5．5、6．5 h为时间研究变量(其他条件不变)，考察连续超声时间对反应的影响。

1．2．4 超声功率对反应的影响

在最适超声介质中设定 50、60、70、80、90 W 为超声功率研究变量(其他条件不变)，考察超声功率对反应的影响。

1．2．5 超声介质中水分含量对反应的影响

在最适超声介质中，设定加水量(以水分与脂肪酶的质量比计算)在0%、1%、2%、4%、6%、8%、10%为研究变量(其他条件不变)，考察水分含量对反应的影响。

1．2．6 温度对反应的影响

在最适超声介质中，设定 45、50、55、60、65 ℃为温度研究变量(其他条件不变)，考察温度对反应的影响。

1．2．7 酶用量对反应的影响

在最适超声介质中设定5%、10%、15%、20%、25%、30%(以酶与底物的质量比计算)为酶用量研究变量(其他条件不变)，考察酶用量对反应的影响。

2 结果与讨论

2．1 超声介质对反应的影响

2．1．1 超声介质的种类对反应的影响

有机溶剂的疏水性是影响酶稳定性的重要因素之一，一般说来，在疏水性较强的介质中，因不易夺取维持酶分子构象的必需水，从而使酶具有较高的反应活性，符合 Laane提出的 log P(疏水常数)规则［4］。本研究选用异辛烷、正庚烷、正已烷等3种疏水性较强的溶剂为酶反应介质，其log P排列顺序是异辛烷＞正庚烷＞正已烷。结果显示(表1)，以正庚烷为介质的反应体系所得到的产物中DHA－EPA总含量最高，这一结果不完全符合3种溶剂的log P值排列顺序，说明疏水性只是溶剂的特性之一，溶剂对酶反应活性的影响是复杂的，不仅与疏水性相关，也与溶剂对酶构象的改变、溶剂分子与酶活性中心的结合等因素都有关系［5，6］。

表1 不同溶剂对反应的影响

2．1．2 不同超声介质复配对反应的影响

有机溶剂的疏水性不仅影响有机相酶反应的酶活性，也影响酶选择性，且更为复杂，与酶在溶剂中的构象变化以及酶、底物、溶剂三者之间的相互作用等均有关系。为使酶既获得高活性，又有高选择性，本研究以正庚烷为主溶剂，异辛烷、正已烷为助溶剂，考察了不同溶剂按体积比组合后的反应效率(表2)，结果显示，按一定体积比复配溶剂反应效率比单一溶剂有所提高，其中以正庚烷∶异辛烷∶正已烷 =8∶1∶1(体积比)时反应效率最高，这表明，在此条件下，酶的疏水性与选择性达到最佳，可作为后续研究的反应溶剂。

表2 溶剂复配对反应的影响

2．1．3 超声介质添加量对反应的影响

溶剂作为超声介质，在有机相酶反应中可以促使底物溶解，使酶与底物充分接触以提高反应效率。但溶剂添加过多，也会使底物稀释，降低反应效率。以正庚烷∶异辛烷∶正已烷=8∶1∶1为溶剂，不同的溶剂(mL)与底物(g)之比进行试验，结果显示(图1):当溶剂/底物＜2．0时，由于接触面积不断扩大，反应效率随着溶剂的增加而提高，且在溶剂/底物=2．0时达到最佳。而随着溶剂量的继续增加，由于底物不断被稀释，反应效率也逐渐降低。

图1 溶剂添加量对反应的影响

2．2 单因素试验

2．2．1 连续超声时间对反应的影响

在正庚烷∶异辛烷∶正已烷 =8∶1∶1，溶剂/底物 =2的反应体系中，以不同的连续超声时间为研究变量进行试验，结果显示(图2):在连续超声时间低于4．5 h时，产物中DHA－EPA含量快速上升，当连续超声时间为5．5 h时，产物中DHA－EPA含量上升速度趋缓，当连续超声时间达到6．5 h时，上升速度进一步趋缓，这可能是由于长时间的超声作用使酶活力下降或反应达到平衡所致。考虑到经济效益，应以反应时间5．5 h为宜。

图2 连续超声时间对反应的影响

2．2．2 超声功率对反应的影响

分别设定不同的超声功率，考察了超声功率对反应的影响。结果显示(图3)，超声功率对反应的影响较大，在低强度的超声辐照下，随功率的增大，酶被逐渐激活，在功率为70 W时，产物中DHAEPA含量达到最高，而进一步提高超声功率，酶活急剧下降，导致产物中DHA－EPA含量也快速降低。

图3 超声功率对反应的影响

2．2．3 超声介质中水分含量对反应的影响

在有机介质中，微量水对维持酶的构象以及发挥酶催化作用是必需的，体系中含水量过低，酶构象变得过于“刚性”，而抑制酯交换反应;但含水量过高时，酶结构的“柔性”过大，会引起酶结构的改变，甚至导致酶失活。只有严格控反应体系中的水分，使酶的“刚性”与“柔性”达到一个平衡点，才能发挥酶的最大活力。对于固定化酶Lipozyme TL IM来说，水分含量过高，还可能使固定在硅胶上的脂肪酶溶解，因而特定的反应需要确定其最佳水分含量。由图4可见，当加水量从0%至2%时，产物中DHAEPA含量增加，当加水量大于2%时，产物中DHAEPA含量呈下降趋势，可见Lipozyme TL IM参加的酶反应所需水分很少，这可能与其自身所含的水分较大有关。

图4 超声介质中水分含量对反应的影响

2．2．4 温度对反应的影响

Lipozyme TL IM的耐热性较强，即使在70℃下短时间内也有较大的活性，但考虑到长时间高温易引起酶的失活，不利于酶的循环利用，而且高温也会促使含有多个双键的DHA、EPA等底物发生氧化反应，故在45～65℃温度范围内探寻适宜温度，结果表明(图 5)，在反应温度低于 55℃时，产物中DHA－EPA含量快速上升，当反应温度高于55℃时趋于平缓，如增加反应时间，则DHA－EPA含量有所下降，故选择55℃作为后续试验的最适温度。

图5 温度对反应的影响

2．2．5 酶用量对反应的影响

在酯化反应中，国内外研究较多的成品酶是固定化Novozym 435，其催化速率快，产率高，但成本也高，不利于工业化，而固定化脂肪酶Lipozyme TL IM价格低，但酶活性较低，用量较大，通常和Novozym 435混合使用，以降低成本［7］。本研究在反应体系中分别加入5%、10%、15%、20%、25%、30%的固定化脂肪酶 Lipozyme TL IM，结果显示(图6):初始时(5%、10%)加酶量少(5% ～10%)，酶不能充分催化底物，产物中DHA－EPA含量增加缓慢，当加酶量达到15% ～25%时，DHA－EPA含量增加显著，当加酶量达到30%时，DHA－EPA含量增加再次趋缓，说明这时酶分子已基本饱和反应界面。为节约成本，酶用量应以25%为宜。

图6 酶用量对反应的影响

2．3 酯交换前后磷脂的脂肪酸组成分析

对原料大豆卵磷脂及最佳工艺条件下酯交换磷脂产品进行GC/MS分析，图7显示:原料大豆卵磷脂由棕榈酸(15．81%)、亚油酸(38．34%)、油酸(30．86%)、硬脂酸(6．37%)、亚麻酸(8．62%)等组成。由图8可知，酯交换后磷脂产品由棕榈酸(14．45%)、亚油酸(25．84%)、油酸(22．90%)、硬脂酸(5．81%)、亚麻酸(8．01%)、EPA(14．58%)、DHA(8．41%)等组成，即交换到大豆卵磷脂上的EPA及DHA质量分数之和为22．99%。

3 结论

综合以上单因子试验的最佳条件，即在正庚烷∶异辛烷∶正已烷 =8∶1∶1为超声介质，溶剂/底物 =2，酶用量为25%，超声介质中水分质量分数为2%，超声功率70 W，55℃下连续超声5．5 h，可获得DHA－EPA质量分数为22．99%。由此可见，通过超声辅助及酯交换条件的优化，不仅可以大大缩短反应所需的时间，而且也能充分激活Lipozyme TL IM的酶活力，从而提高酯化反应的效率，但本研究中最适酶用量为底物质量的25%，需求量较大，若应用于工业化生产还需进一步优化反应条件，以降低成本。

［1］潘丽，谷克仁，杨壮．制备富含n－3多不饱和脂肪酸的磷脂［J］．粮油加工，2006，(12):57－60．

［2］金华丽，谷克仁．脂肪酶催化大豆磷脂改性的研究［J］．中国粮油学报，2009，24(7):33－36．

［3］寇秀颖，于国萍．脂肪和脂肪酸甲酯化方法的研究［J］．食品研究与开发，2005，26(2):46－47．

［4］Laane C，Boeren S，Vos K，et al．Rule for optimization of biocatalysis in or ganic solvent［J］．Biotec hnol bioeng，1987，30:81－87

［5］Ueji S，Fujio R，Okubo N．Solvent－induced inversion of enantioseletivity in lipase－catalyzed esterification of 2－p henoxypropionic acids［J］．Biotec hnol Letters，1992，14:163 －166

［6］Secundo F，Riva S，Carrea G．Effect of medium an of reaction conditions on the enantioselectivity of lipases in or ganic solvent an possible rationales［J］．Tetra hedron:Asymmetry，1992(3):267－269

［7］Lilin Li，Wei Du，Dehua Liu，et a1．Lipase—catalyzed transesterifieation of rapeseed oils for biodiesel production with a novel or ganic solvent as the reaction medium［J］．Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic，2006，43:58－62．

Assistant of Ultrasonic Irradiation Synthesize Phospholipids Enriched with n－3 Polyunsaturated Fatty Acids by Lipase

Zhan Zhonggen
(Zhejiang Economic＆ Trade Polytechnic，Hangzhou 310018)

The optimum reaction conditions of synthesized phospholipids enriched with n－3 polyunsaturated fatty acids by Lipase(Lipozyme TL IM)were studied．Results showed that:mixed solvent proportion(n－heptane:iso－octane:hexane)was 8∶1∶1(V/V/V)，solvent and substrate ratio was 2∶1，Lipozyme TL IM addition was 25%，water content of organic solvent was 2%，power of Ultrasonic Irradiation reaction was 70 W，temperature was 55 ℃ and reaction time was5．5 h．Under the optimum conditions of transesterification，the incorporation of EPA and DHA was 22．99%．This showed that the reaction time was reduced and the activity of Lipozyme TL IM was enhanced greatly by assistance of ultrasonic irradiation and optimum conditions of transesterification．

assistance by ultrasonic irradiation，lipase，n－3 polyunsaturated fatty acids

TS201．2

A

1003－0174(2011)11－0042－05

2011－02－07

詹忠根，男，1971年出生，副教授，食品生物技术