电化学实时定量PCR仪热循环系统温度特性研究

熊 亮 陈旭海 李玉榕 杜 民*

1(福州大学电气工程与自动化学院，福州 350108)

2(福建省医疗器械和医药技术重点实验室，福州 350002)

引言

聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)是体外酶促合成特异 DNA片段的一种方法，由高温变性(90～96℃)、低温退火(25～65℃)及适温延伸(70～75℃)三步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以按几何级数倍增。链式反应的关键是三温循环的控制，要求温度变化快、精度高、温度均匀性与恒温性好［1］。

电化学实时定量PCR，是一种采用电化学分析法对PCR反应中特定DNA序列进行检测的一种非光学实时定量PCR技术。该技术克服了目前应用广泛的荧光实时定量PCR技术的缺点，如光学仪器复杂、体积大、不利于小型化，通道数受光学装置限制，需考虑仪器严格的蔽光性及荧光基团的特异性;同时检测过程简单，只需在PCR混合物中添加少量易于处理和储存的氧化还原催化剂，就可以用电化学分析技术实现对较长DNA片段的检测，且特异性强。此外，除具有实时PCR技术测量范围宽、定量准确、精度高和速度快的优点外，还具有可在扩增过程中进行实时定量检测的特点(发生在电极表面)，是一种成本更低、更可靠、更易于小型化的非光学实时定量检测技术［2］。小型化已日渐成为一种趋势，将生物芯片应用于实时定量PCR技术，能够进一步缩小仪器尺寸。PCR芯片作为生物芯片的重要分支，是当今生物芯片研究的热点之一［3］。相对于传统的 PCR扩增单元，利用 PCR芯片来实现DNA扩增，热容量小，变温迅速，试剂消耗量大大减少，设备体积小，有利于便携式PCR的研制［4－5］。所要研究的 PCR仪热循环系统采用电化学实时定量多通道PCR芯片来作为扩增单元。

当利用实时定量PCR进行检测时，有许多因素影响检测结果的准确性，其中PCR仪的温度特性起着至关重要的作用，PCR在运行温度上的细微差别都可能导致迥然不同的结果［6］。相对于传统 PCR扩增单元而言，PCR芯片虽因其热容量小而变温更迅速，但也存在一定程度的温度热迟滞性和不均匀性，尤其在采用电化学实时定量检测技术的PCR芯片中，由于隔热材料、电极布局等因素的影响，温度热迟滞性和不均匀性更加明显。为了实现电化学多通道的实时定量测量，亦要求各孔试剂反应条件一致、扩增速率相同，这就需要确保各孔温度具有良好的一致性。因此，必须从热力学的角度，对芯片整体进行优化设计，以提升温度控制的精度，进而提高DNA片段扩增的效率，取得更好的PCR扩增效果［7］。

笔者围绕PCR仪工作性能对温度特性的要求，对普通 PCR芯片［2，4］的结构和材料进行了优化，以改善芯片的温度一致性与热迟滞性，设计了一种环形、三层结构的多通道电化学实时定量PCR芯片。利用大型有限元仿真软件ANSYS10.0，对PCR芯片进行热分析研究;通过稳态分析，确定隔热层厚度和热补偿温度，削弱芯片与外围空气的对流换热作用，以改善芯片的温度准确性与均匀性。在稳态分析的基础上，又通过瞬态分析对芯片的温度热迟滞性与恒温性进行了测试。稳、瞬态分析结果表明，该芯片满足PCR仪工作性能对温度特性的要求。

1 PCR芯片结构

围绕PCR仪工作性能对芯片各通道温度一致性与热迟滞性的要求，在普通PCR芯片的基础上，对芯片结构和所用材料进行了优化。

在传统方形结构中，边缘孔的外部边界条件不一致，位于4个棱角处的试剂孔相对于其他边缘孔，具有更大的对流面积，导致芯片各孔温度一致性欠佳。为使芯片外形结构更加合理，满足PCR仪对于温度的一致性的要求，利用具有对称性的环形结构来改进该芯片。环形结构中试剂孔完全对称，不仅使各孔试剂反应条件完全一致，还使各孔电极也对称，使芯片各孔温度的一致性从根本上得以改善。芯片内部采用了如图1所示的反应池(容量为38.5 μL)内固定式扩增结构，分上中下3层，由下往上依次是单晶硅片、铝片和聚碳酸酯(PC)上盖，各层之间采用键合技术进行封接(见表1)［8－9］。铝片穿有试剂孔，为了隔绝试剂与铝材的化学作用，防止铝片被腐蚀、试剂被污染，孔内侧表面生成有一层聚对二甲苯防护膜［10］。单晶硅片虽然具有良好的导热性，但是其电绝缘性较差，因此在相应于试剂孔的位置制作电极(电极从硅片中引出)前，需在硅与电极之间生长一层绝缘层。本研究采用的是Si3N4-SiO2双层结构，一薄层的氮化硅既耐腐蚀又能阻止碱金属离子的污染，SiO2层则可以降低界面态和陷阱，解决电荷不稳定的问题。另外，氮化硅与硅之间的二氧化硅层还可以改善氮化硅的附着能力，从而提供一个连续的界面［4］。聚碳酸酯上盖用于对孔进行密封并留有加样口，还起到隔热的作用，更重要的是利用其透红外性能，使红外测温能够应用于PCR仪中(热像仪置于芯片正上方)。PCR仪选用半导体加热制冷片(TEC)置于芯片的底面，对其进行加热和降温，芯片与TEC之间涂有导热胶。普通PCR仪常将温度传感器置于样品基座上，导致测量温度和试剂温度之间存在着时间滞后［11］。该芯片可与红外测温结合，能够快速直接地测量热源温度(TEC上表面温度)和试剂温度，进而优化控制策略，取得良好的PCR扩增效果。

表1 材料参数Tab.1 Material parameters

2 PCR仪热循环系统有限元仿真

2.1 实体建模与网格划分

环形反应池内固定式扩增结构实体模型如图2所示，规格如图1(b)所示。有限元分析过程采用3-D模型，结构复杂，节点数目巨大，分析时间长。为了保证分析的准确性及可靠性，对4种材料都使用Tet 10 Nodes 87热分析单元，网格尺寸控制采用的是 Manual Size→Lines→All Lines，划分尺寸为0.001，划分后的网格如图2所示。

2.2 稳态分析

2.2.1 稳态热传导方程及边界条件

图1 芯片结构。(a)俯视图;(b)纵剖视图Fig.1 The architecture of the chip.(a)top view;(b)longitudinal section view

如果一个系统的净热流率为0，即流入系统的热量Qi加上系统自身产生的热量Qg等于流出系统的热量Qo，则系统处于热稳态。在稳态热分析中，任意节点的温度不随时间变化，热稳态的条件为［12］

PCR仪在工作时，是将芯片温度加热到一个设定值，再保持这个温度设定的时间。在芯片温度到达设定值而进入保持阶段后，芯片就达到一个稳态传热的状态［7］。由于PCR仪芯片的结构复杂，而且芯片没有内热源，所以导热问题只能用在笛卡尔坐标系中稳态、无内热源条件下的导热微分方程描述［7，13］，有

图2 网格划分Fig.2 The picture of mesh division

芯片稳态热分析的边界条件包括:芯片底面的第一类边界条件、芯片其余表面对流换热的第三类边界条件。芯片底面与产热率相同的半导体加热制冷片接触，当加热到温度设定值时，芯片底面与半导体加热制冷片的接触面保持恒定温度。由于热源温度tw=94℃时各表面的对流换热系数最大，对芯片温度准确性与均匀性的影响最明显，所以只分析芯片在该温度时的温度场［7］。

芯片除底面加有热源外，其余表面与空气都存在自然对流，这是影响芯片温度准确性与均匀性的一个重要因素，应该尽可能地削弱对流换热所带来的不利影响。当芯片厚度面积比很小时，由侧面空气对流损失的热量几乎可以忽略不计。而对芯片温度准确性与均匀性产生最大影响的当属来自于上表面的空气对流散热，这属于水平壁面热面向上的自然对流换热问题。对于空气对流换热引起的温度场温差，由牛顿对流换热冷却公式Φ=hA(tw-tf)可知，在接触面积A、热端温度 tw不变的前提下，芯片单位时间内通过空气对流换热损失的热量Φ完全由对流换热系数h和环境空气温度tf决定。如果要减小空气对流换热对温度准确性与均匀性的影响，就必须减小hw或者增大tf。

在室温(20℃)下，当上表面对流换热系数值为11.84 W/m2·K、侧壁对流换热系数值为20.58 W/m2·K时，芯片各孔的试剂温度分布如图3所示。此时，芯片的温度准确性与均匀性误差分别为1.061℃和1.06℃，不能满足PCR仪工作性能的要求。不过，由于芯片采用了环形结构，各孔的温度一致性误差为0℃。

2.2.2 改进措施

图3 改进前芯片中的试剂温度分布Fig.3 The picture of reagent’s temperature distribution before the improvement of the chip

由于隔热和热补偿都有利于减少芯片与空气对流换热而损失的热量Φ，因此采用两者相结合的措施来改善热循环系统。首先，通过仿真分析确定有限元模型的隔热层厚度，即特征尺度 lc;然后，在隔热仿真分析结果的基础之上对空气施加热补偿，即提高周围空气温度tf，进而分析确定热补偿温度。

在隔热仿真分析中，室温下侧壁隔热层取38 mm为最佳厚度(即上表面lc值为118 mm)，该厚度是层流转换为湍流的一个边界厚度［13］，这时上表面对流换热系数值最小约为9.07 W/m2·K。在此基础上，再对芯片进行热分析，以确定上盖厚度。

2.3 瞬态分析

瞬态传热过程，是指一个系统的加热或冷却的过程。在这个过程中，系统的温度、热流率、热边界条件以及系统内能随时间都有明显变化。瞬态传热分析的基本步骤与稳态热分析类似，不同的是瞬态热分析中的载荷是随时间变化的［12］。为了测试改善后的PCR仪热循环系统中芯片反应池的热迟滞性和恒温性，特设定一组工作参数对其性能进行了测试。测试时在芯片中选择了一个测试孔，并以孔中轴线上中心节点及下端点作为具体测试点。设定的3个温度点分别为 94、55和 72℃，在3个温度点停留的时间分别为 60、60和120 s。

3 结果

3.1 稳态分析结果

芯片隔热仿真分析结果如图4所示，温度准确性误差值与温度均匀性误差值仅相差0.001℃，温度准确性误差曲线与温度均匀性误差曲线几乎完全重合。当上盖厚度在0.05～3 mm的范围之内时，温度准确性误差与温度均匀性误差在0.74～0.85℃之间;在最佳状态(上盖取1.5 mm，即侧壁lc值为2.925 mm)时，温度准确性误差和均匀性误差分别为0.741和0.74℃，芯片温度特性得到一定的改善，但试剂中央温度仍达不到实验的要求。可见，单独采用隔热措施虽能够部分改善芯片的温度准确性与均匀性，但不能很好地满足 PCR扩增的要求。

图4 上盖隔热仿真结果Fig.4 Simulation result for the top cover’s heat insulation measure

在添加隔热层仿真结果的基础上，考虑到芯片的温度特性、制作的工艺条件及后续PCR仪研发中红外测温的应用，芯片上盖和侧壁分别取0.05和38 mm厚的聚碳酸酯隔热层。采取隔热和热补偿相结合的改进措施时，其有限元仿真结果如图5所示。当热补偿温度处于70～100℃时，温度准确性与均匀性误差都小于0.2℃，能够满足PCR扩增的要求。当tf=70℃时，试剂温度分布如图5(b)所示，温度一致性误差为0℃，温度准确性与均匀性误差同为0.176℃。可见，采取隔热和热补偿相结合的改进措施，明显改善了芯片的温度准确性与均匀性。

3.2 瞬态分析结果

图6为芯片在 tf=70℃，温度循环历时4 min时，试剂的温度循环特性曲线。可见，升降温速率分别为4和3℃/s，能够满足 PCR仪工作性能的要求。

4 讨论

在稳态分析中，隔热仿真结果表明，隔热层的添加能够部分改善芯片的温度准确性与均匀性。当上盖厚度在0.05～3 mm的范围之内时，温度准确性误差与温度均匀性误差在0.74～0.85℃之间，最小误差分别为0.741和0.74℃，仍达不到PCR扩增的要求。这主要是因为隔热层不仅起到隔热的作用，还是热负载;当其厚度大到一定程度时，将对芯片温度准确性与均匀性起到主要影响作用。芯片由于尺寸太小、厚度面积比偏大，导致上表面对流散热过多(研究发现下表面对流影响不大，可忽略);而上表面隔热层的添加虽有助于侧壁对流系数的减小，但同时也成为芯片的热负载，使整体热阻增大。

图5 隔热层确定后添加热补偿措施。(a)隔热层确定后的热补偿措施仿真结果;(b)tf=70℃时的试剂温度分布Fig.5 The thermal compensation measure after the confirmation of the heat insulation.(a)simulation result for the thermal compensation measure after the confirmation of the heat insulation;(b)the picture of reagent’s temperature distribution at tf=70℃

图6 tf=70℃时的节点温度变化Fig.6 The picture of nodes’changing temperature at tf=70℃

温度场的仿真结果表明，隔热和热补偿相结合的改进措施明显改善了芯片的温度准确性与均匀性。当热端温度取94℃时，在上盖和侧壁分别添加0.05和38 mm厚的聚碳酸酯隔热层。在热补偿温度处于70～94℃时，芯片的温度准确性、均匀性误差与热补偿温度值基本呈线性递减的变化趋势，都小于0.2℃;在热补偿温度处于94～100℃时，芯片的温度准确性、均匀性误差虽也小于0.2℃，但是温度误差曲线呈上升趋势。此外，芯片由于采用了环形结构，其各孔的温度一致性误差为0℃，该热循环系统能够满足PCR仪工作性能对温度一致性、温度准确性与均匀性的要求。PCR仪工作时，应使热补偿温度尽量与加热温度相当，这样对流不明显，起主要热交换作用的是热传导［13］，而空气的导热系数又非常低，因此能够极大地削弱上表面的对流散热能力。热补偿温度的确定，还应考虑下阶段链式反应的温度控制问题。

瞬态分析关于改善后的PCR仪热循环系统温度场动态分布仿真结果表明，该芯片反应池的热迟滞性与恒温性满足PCR仪工作性能的要求。在tf=70℃、温度循环历时4 min时，试剂升降温速度分别为4和3℃/s。

5 结论

本研究围绕PCR仪工作性能对温度特性的要求，对普通PCR芯片的结构和材料进行了优化，以改善芯片的温度一致性与热迟滞性，设计了一种环形、3层结构的电化学实时定量多通道 PCR芯片。利用大型有限元仿真软件ANSYS10.0，对PCR芯片进行热分析研究，稳态分析确定了隔热层厚度和热补偿温度来削弱芯片与外围空气的对流换热作用，以改善芯片的温度准确性与均匀性。在稳态分析结果的基础之上，又通过瞬态分析对芯片的温度热迟滞性与恒温性进行了测试。稳、瞬态分析结果证明，改善后的热循环系统温度特性能够满足PCR仪工作性能的要求。本研究为开发实时定量的PCR仪提供了一定的理论支持。

［1］胡林艳，唐小萍 用DSP控制单元实现PCR温度控制的方法［J］.微纳电子技术，2004，8:45－47.

［2］ThibautD，MichelD，Murielle RD，etal. Real-time electrochemical monitoring of the polymerase chain reaction by mediated redox catalysis［J］.Journal of the American Chemical Society.2009，131(32):11433 －11441.

［3］Yeung SSW，Lee TMH，Hsing IM.Electrochemistry-based realtime pcr on a microchip［J］.Analytical Chemistry.2008，80(2):363－368.

［4］刘大震，闫卫平.硅基单反应腔PCR生物芯片的设计与制作［D］.大连:大连理工大学，2004.

［5］Fang TH，Ramalingam N，Dong XD，et al.Real-time pcr microfluidic devices with concurrent electrochemical detection［J］.Biosensors and Bioelectronics.2009，24(7):2131 － 2136.

［6］程远霞，魏燕，鲁祥友，等.PCR温度特性实验研究与分析［J］.生命医学仪器，2008，6(6):52 －56.

［7］陈世泽，陈章位，黄靖，等.PCR仪温度控制均匀性研究与仿真分析［J］.中国生物医学工程学报，2009，28(4):610－614.

［8］章春笋，徐进良.连续流动式 PCR芯片相关技术研究进展［J］.分析测试学报，2004，23(6):114 －118.

［9］刘大震，闫卫平，郭吉洪，等.PCR生物芯片微反应腔的制作及其热分析［J］.微纳电子技术，2003，40(7):321－323.

［10］Shin YS，Cho K，Lim SH，et al.Pdms-based mirco pcr chip with parylene coating［J］. JournalofMic-romechanics and Microengineering.2003，13(5):768 －774.

［11］Huang Jingchen，Zhang Wei，Yao Yinghao，et al.Simulation and experimental study of temprature lag time for polymerase chain reaction instrument［C］//Proceedings of the 3rd International Conference on Biomedical Engineering and Informatics.Yantai:IEEE，2010:1591－1594.

［12］张朝晖.ANSYS 8.0热分析教程与实例解析［M］. 北京:中国铁道出版社，2005.

［13］戴锅生.传热学［M］.北京:高等教育出版社，2003.