水通道蛋白4抗体测定的临床意义①

邵文君 郭 涛 杜彦辉 (宁夏医科大学，银川750004)

视神经脊髓炎(Neuromyelitis optica，NMO)，又称Devic病、Devic综合征，是一种先后或同时累及视神经和脊髓的急性或亚急性脱髓鞘疾病[1]。由于视神经脊髓炎和多发性硬化在临床表现上的某些相似处及难以及时准确的诊断，关于视神经脊髓炎是一个独立的疾病还是多发性硬化的一种临床亚型一直都在备受关注的争议，但是越来越多的研究证据表明，NMO是一种独立的疾病。从2004年Lennon等[2]在 NMO患者血清中发现了一种特异性NMO-IgG 自身抗体到 2006 年 Wingerchuk 等[3，4]把血清NMO-IgG阳性列入NMO的诊断标准中，可见NMO-IgG抗体检测对于支持诊断NMO的重要性，但是目前国内此项抗体检测手段尚不成熟，绝大多数医院还未开展对NMO-IgG的检测。我们采用间接免疫荧光方法检测NMO-IgG抗体，熟悉NMO-IgG抗体测定的过程，并观察中枢神经系统脱髓鞘疾病及非脱髓鞘疾病的NMO-IgG测定结果，进一步证实NMO-IgG抗体检测的临床意义。

1 对象与方法

1.1 对象 收集2010年7月～2011年10月宁夏医科大学依据 Wingerchuk等[4]有关 NMO诊断标准，诊断为NMO的患者9例，均为女性，发病年龄17～31岁，病程1～6年，发病次数为2～5次;并收集同期住院的多发性硬化(Multiplesclerosis，MS)患者10例，均符合 2001年 Mcdonald诊断标准[5];NMO的临床诊断标准[6]:根据患者出现急性起病，双侧同时或相继发生的视神经炎，急性横贯性或播散性脊髓炎的临床表现，结合MRI显示视神经和脊髓病灶，视觉诱发电位异常，CSF-IgG指数增高和出现寡克隆带等。神经科其他疾病患者46例，其中急性脊髓炎8例，脱髓鞘性脊髓炎5例，脑脊髓炎3例，脑血管病30例。

1.2 方法

1.2.1 血清制备 取得患者或监护人知情同意签字后，抽取研究对象清晨空腹静脉血标本3～5 ml，进行离心(转速3 000 r/min，离心10分钟)，取上层血清，储存于-80℃冰箱备用。

1.2.2 普通成年小白鼠脑组织冰冻切片 轻柔地取出完整的成年小白鼠脑组织，无过度牵拉和破损，取小鼠脑干和小脑部分制备成10 μm的脑片，4%甲醛固定后保存于-80℃冰箱备用。

1.2.3 NMO-IgG的检测 取出制备好的脑片，10%正常山羊血清封闭，37℃、30分钟;用PBS漂洗三次;加血清标本(稀释度为1∶150)，37℃孵育1小时;PBS漂洗三次;加荧光素标记抗体FITC羊抗人IgG(抗体稀释度为1∶100)，避光，37℃孵育30分钟;PBS避光漂洗三次;避光DAPI染核10分钟，PBS再漂洗三次;直接封片后尽快置于荧光显微镜下观察，即间接免疫荧光法检测各组血清NMO-IgG抗体。

1.3 统计学处理 应用SPSS11.5统计软件进行分析。特异性=抗体检测阴性的例数/患者组非NMO疾病谱例数×100%，敏感性=抗体检测阳性的例数/患者组属NMO疾病谱例数×100%。

2 结果

对配对四格表资料进行卡方检验，结果提示临床诊断NMO及非NMO病例组患者应用NMO-IgG定性检测阳性率存在统计学差异(P＜0.05)。

血清AQP4抗体检测阳性如图1所示，NMO与非NMO患者血清NMO-IgG抗体检测结果如表1所示，9例 NMO患者血清 NMO-IgG阳性 8例(88.9%);10例MS患者NMO-IgG阳性2例(20%);神经科其他疾病患者阳性2例(4.3%)，其中急性脊髓炎1例，脑脊髓炎1例。其余患者AQP4抗体检测均为阴性(见图2)。NMO-IgG抗体方法诊断NMO的敏感性88.9%，特异性为91.1%。

图1 AQP4抗体检测阳性(×60)Fig.1 AQP4 antibody test positive(×60)

表1 NMO-IgG检测方法对临床诊断的NMO及非NMO患者的四格表Tab.1 The 4 case table of NMO-IgG detection methods to NMO and not NMO patients

图2 AQP4抗体检测阴性(×60)Fig.2 AQP4 antibody test negative(×60)

3 讨论

AQP家族是近几年来逐渐被发现并认识的一类水特异性膜内在蛋白，在哺乳动物组织中已发现13种水通道蛋白(AQP0～AQP12)[7]。迄今已在脑内已发现7 种AQP，分别是 AQP1、3、4、5、8、9、11，其中水通道蛋白4(AQP4)为主要在脑组织中表达的水通道蛋白。AQP4是中枢系统发现最早的水通道蛋白，广泛分布于中枢胶质界膜、室管膜、海马齿状回、下丘脑的视上核和室旁核和脑表面的软脑膜、小脑Purkinje细胞、脑微血管的细胞表面。它是胶质细胞与脑脊液以及血管间的水调节和转运的重要结构基础[8]。

2004年NMO特异性水通道蛋白4抗体(AQP4-Ab)的发现，更加支持NMO是一种有别于MS的自身免疫性水通道病，NMO与MS治疗及预后存在很大不同:在治疗方面，NMO主张以免疫抑制剂治疗为主[如:硫唑嘌呤(AZP)、米托葱醒(Mix)、静脉丙种球蛋白(IVIg)][9，10]。而 MS 则多主张以免疫调节治疗为主[如:干扰素(IFN)、醋酸格拉太咪尔(GA)][11]。预后方面，NMO 因为存在较高的死亡率及严重病残率，故预后比MS差。因此对于NMO的鉴别诊断对其进行合理治疗是很有必要的。疾病是否处于活动期及大剂量激素治疗等对血清抗体滴度有一定影响，因此对抗体检测结果也有一定影响，本组NMO患者有一例血清抗体检测结果为阴性，查其血样标本留取时间是在使用激素治疗后1周。且本组MS病人有2例及1例急性脊髓炎患者及1例脑脊髓炎患者检测结果为阳性，此例急性脊髓炎患者2月后再次复发而诊断为NMO，对NMO-IgG抗体检测结果为阳性者给予高度重视，观查其临床表现及复发情况等。

目前抗体NMO-IgG的血清学检测阳性已成为NMO最新诊断标准的支持条件之一[4]。对于本组研究结果显示，采用间接免疫荧光法初步检测到我院神经内科收住的患者2010年7月～2011年10月期间NMO患者血清NMO-IgG，其诊断NMO的灵敏度为88.9%，特异度91.1%。这与国外相关报道NMO-IgG抗体检测在诊断NMO上具有高度灵敏性及特异性相近，提示NMO-IgG可作为国内NMO诊断的重要生物学指标。由于本项NMO-IgG检测仅是一种较粗糙的抗体定性检测方法。该方法仍待改进以提高抗体检测的灵敏度。且本组实验测定患者血清标本量较小，但也能说明本实验方法是可取的，采取更精细的实验方法及大量的血清标本检测为临床诊断提供更准确的参考标准是以后的发展方向，尤其是如果有更为便捷的试剂盒检测，为NMO-IgG抗体的测定提供更为方便且客观标准的检测平台，如对NMO-IgG抗体进行定量检测，分析一定范围的抗体量对于疾病处于某段时期的意义及临床指导作用，将对NMO疾病的攻破有着更为深远的意义。因本实验用到小鼠脑组织，对于取材时的细微差异、血样标本留取时间的差异如入院未能及时留取标本及观测结果对于观察者来说有一定的主观性等多方面因素的存在，因此检测结果的客观性不够强，但是综合整个实验检测结果的确有一定的意义。

在2007年 Takahashi等[12]为代表的采用人AQP4转染细胞检测抗人AQP4抗体，这种方法较2004年Lennon等NMO-IgG检测方法敏感性更高。当血清抗体滴度较低时用Lennon等所采用NMOIgG检测方法检测结果可能为阴性，但采用人AQP4转染细胞检测法则会是阳性结果。文献表明，运用人AQP4转染细胞作为间接免疫荧光测定的酶作用底物，抗AQP4抗体测定对NMO的敏感性分别是91%，特异性是100%[11]。抗体测定的方法仍在提高其准确性及为临床带来的便易及实用性，我们期待NMO-IgG的测定有更美好的未来，同时对于AQP4作为NMO自身免疫反应攻击的靶点，使NMO的免疫和病理研究进入了一个新的阶段，给NMO的治疗提供了新思路，或许将来AQP4可能成为NMO药物治疗的作用靶点，阻断NMO的免疫进程，为NMO的治疗开启一个新的领域。

1 Devic C.Myelite subaigue compliquee de nevrite optique[J].Bull Med，1894;35:18-30.

2 Lennon V A，Wingerchuk D M，Kryzer T J et al.Aserum autoantibody markerof neuromyelitis optica[J].Lancet，2004;364:2106-2112.

3 Weinshenker B G，Lennon V A，Wingerchuk D M et al.The spectrum of neuromyelitis optica[J].Lancet Neurology，2007;6(9):805-815.

4 Wingerchuk D M，Lennon V A，Pittock S J et al.Revised diagnostic criteria for neuromyelitis optica[J].Neurology，2006;66(10):1485-1489.

5 McDonald W I，Compston A，Edan G et al.Recommended diagnostic criteria for multiple sclerosis:guidelines from the International Panel on the diagnosis of multiple sclerosis[J].Ann Neurol，2001;50(1):121-127.

6 王维治.神经病学[M].北京:人民卫生出版社，2006:265-265.

7 Zelenina M，Zelenin S，Aperia A.Water channels(aquaporins)and their role for postnatal adaptation[J].Pediat Res，2005;57(5 Pt2):47R-53R.

8 杨文茜，潘冰冰，王云姣 et al.水通道蛋白4的研究进展[J].中国实用医药，2009;4(20):238-241.

9 Weinshenker B G，O'Brien P C，Petterson T M et al.A randomized trial of plasma exchange in acute central nervous system inflammatory demyelinating disease[J].Ann Neurol，1999;46(6):878-886.

10 Watanabe S，Nakashima I，Misu T et al.Therapeutic efficacy of plasma exchange in NMO-IgG positive patients with neuromyelitis optica[J].Mult Scler，2007;13(1):128-132.

11 Chen M，Gran B，Costello K et al.Glatiramer acetate in duces a Th2-biased response and crossreactivity with myelin basic protein in patients with MS[J].Mult Scler，2001;7(4):209-219.

12 Takahashi T，Fujihara K，Nakashima I et al.Anti-aquaporin-4 antibody is involved in the pathogenesis of NMO:a study on antibody titre[J].Brain，2007;130(5):1235-1243.