骨髓间充质干细胞治疗小鼠胶原性关节炎MMP-2及MMP-9 mRNA表达的影响①

牛广华 高玉洁 高明利 郭 鹤 王柏山 (辽宁中医药大学附属医院，沈阳 110032)

类风湿关节炎(Rheumatoid arthrits，RA)作为一种发病机理不同，治疗效果不佳，致残率很高的自身免疫性疾病，至今无满意的治疗药物，传统的慢作用抗风湿药副作用大，患者耐受性差，新型的生物制剂费用昂贵，不能口服，体内清除快，靶向性差，而骨髓间充质干细胞移植治疗从理论上可克服以上缺陷，是一种新的非常有前途的治疗手段。

骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是一种存在于骨髓中的非造血干细胞，具有自我更新、高度增殖及多向分化的能力。随着对BMSCs研究的不断深入，BMSCs自体或异体骨髓移植已经证实在治疗自身免疫病中有确切的疗效，并已成为治疗自身免疫病的一种新的趋势。

基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases，MMPs)在RA关节骨及软骨的破坏中发挥重要作用[1]。RA患者滑液及滑膜细胞均有MMPs的高表达[2]。MMP-2、MMP-9与RA的病情严重程度及关节破坏相关，MMP-2、MMP-9是明胶酶，其作用的底物是关节软骨的重要组成成分。动物实验也证实，MMP-2、MMP-9与RA的病情严重程度及关节破坏相关。

为此本项目通过BMSCs移植治疗小鼠Ⅱ型胶原性关节炎(CIA)的实验研究，观察BMSCs治疗胶原鼠组织中MMP-2及MMP-9表达的影响，并进一步探讨BMSCs影响MMP表达的调节机制，为BMSCs治疗人类RA提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂及药物 ①牛Ⅱ型胶原(collagen from bovine nasal septutm，C7809，5 mg，Sigma 公司);②弗氏完全佐剂(Fveunds complete adjuvant，098K8729-CAS 9007-81-2，10 ml，Sigma公司);③流式细胞仪抗体 PE-CD34，FITC标记的小鼠抗体(Pharmingen公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 BMSCs的体外分离和表型鉴定 ①以健康C57BL/6(H-2b)小鼠为供体，股骨、胫骨离断，自骨髓腔内获取骨髓标本，收集骨髓标本5份，按2∶1的比例加入Ficoll-Hypaque分离液(密度1.077)中，并采用梯度密度离心法分离单个核细胞，用PBS液洗涤3～4遍，用1 ml生理盐水重悬。②干细胞分选:应用美国BD公司FAcscaliburTM型分选式细胞分析仪;进行骨髓的 CD44+细胞分选。收集分选的CD44+阳性细胞，PBS充分洗涤后，以生理盐水重悬，并调整成浓度为2×106ml-1的细胞悬液。处理完毕的采集物通过低温冻存以备回输。③BMSCs鉴定:流式细胞术检测BMSCs表面抗原，BMSCs高表达 CD29、CD44、CD71，而 CD34、CD45 阴性。分别取100 μl细胞与抗鼠 CD45、CD44、CD105、CD71 抗体在室温下充分反应30分钟，用PBS洗涤2次，重悬于PBS液中，流式细胞仪测定其表型。确定所分离的BMSCs的纯度(具体操作按试剂说明书进行)，用system 11软件分析结果。每个样本至少分析10 000个细胞。

1.2.2 实验分组 近交系C57BL/6(H-2b)小鼠40只，动物年龄45～50天，体重(17±3)克，随机分为:正常对照组、模型组、甲氨喋呤治疗阳性对照组、BMSCs移植治疗组，每组10只小鼠。

1.2.3 建立CIA动物模型 除正常组外，寒冷刺激10天后，将10 mg牛Ⅱ型胶原(BⅡC)与5 ml弗氏完全佐剂研磨后，以每只100 μl于小鼠背部、踝部、尾根部皮内注射免疫，免疫注射14天按上述方法少量再次腹腔内注射，作为激发注射免疫。之后对各组大鼠的发病情况进行观察。主要为关节水肿，皮肤红斑及关节活动情况等。第15天开始移植治疗，于42天对各组小鼠的膝及肘以下关节进行组织病理学分析。

1.2.4 BMSCs(输注)途径及剂量 均采用尾静脉注射途径:CIA小鼠二次免疫接种后第2天，除模型组、正常对照组用生理盐水，余以2×106细胞数/kg体重的密度将BMSCs注入小鼠尾静脉内。

1.2.5 甲氨喋呤(输注)途径及剂量 采用每次甲氨蝶呤0.017 5 g/kg对甲氨喋呤阳性治疗对照组小鼠进行灌胃，每5天一次，直到实验倒数第2天。42天后将小鼠处死取材。

1.2.6 实验场所 辽宁中医药大学动物实验中心、辽宁中医药大学病理技术实验中心。

1.3 MMP-2、MMP-9 mRNA 检测

1.3.1 取材方法 停药后处死小鼠，解剖取肿瘤组织，完整剥离后称重，取脾组织1 cm×0.15 cm×0.15 cm，放入冻存管，迅速投入液氮罐，用以检测MMP-2、MMP-9 mRNA。

1.3.2 RNA提取 采用Trizol一步法RNA提取试剂盒提取脾组织总RNA，用分光光度计测定吸光度值(OD)值，并用电泳法鉴定分子完整性。

1.3.3 逆转录反应 采用逆转录酶链反应(RTPCR)方法。

1.3.4 PCR 扩增 10×Buffer 5 μl，25 mmol/L MgCl23 μl，2.5 mmol/L，dNTP 4 μl，引物各 1 μl，cDNA 10 μl，Taq 酶0.15 μl，加双蒸水后总体积达50 μl，振荡混匀。循环条件:94℃预变性2分钟，94℃变性30秒，57℃退火30秒，72℃延伸30秒，30个循环;72℃后延伸7分钟。扩增产物在112%琼脂糖凝胶上进行电泳，以凝胶成像系统进行半定量分析，用MMP-2、MMP-9与β-actin比值表示其相对表达水平。MMP-2引物序列:上游5'-ATGCGGAAGCCAAGATGTG-3'，下游 5'-GTCCAGGTCAGGTGTGTAAC-3'，扩增产物长度126 bp;MMP-9引物序列:上游 5'-TGAGTCCGGCAGACAATCC-3'，下游5'-CCTTATCCACGCGAATGACG-3'，扩增产物长度432 bp;β-actin引物序列:G1:5'ACCACCATGGAGAAGGCTGG 3';G2:5'CTCAGTGTAGCCCAG-GATGC 3'，扩增产物长度528 bp。

2 结果

2.1 RNA质量鉴定 所提组织总RNA经紫外分光光度计测定:OD260/OD280在1.8～2.0之间，经甲醛变性琼脂糖凝胶电泳，获得了两条较清晰的电泳带，18S和28S，其中28S的量约为18S的两倍，证实RNA的完整性(图1)

2.2 各组MMP-2 mRNA表达水平的影响 MMP-2 mRNA的RT-PCR分析凝胶电泳结果显示，在126 bp处呈现出一特异性条带(见图2)。以528 bp βactin扩增产物作为内参照进行半定量分析(图2、表1)，由表可见CIA鼠模型组脾组织表达的MMP-2 mRNA明显高于正常对照组、甲氨蝶呤治疗组、BMSCs移植治疗组(P＜0.05);而BMSCs移植治疗组与甲氨蝶呤治疗组有显著性差异(P＜0.05)，与正常对照组无显著性差异(P＞0.05)。

2.3 各组MMP-9 mRNA表达水平的影响 MMP-9 mRNA的RT-PCR分析凝胶电泳结果显示，在432 bp处呈现出一特异性条带(见图3)。以528 bp βactin扩增产物作为内参照进行半定量分析(图3、表1)，由表可见CIA模型组脾组织表达的MMP-9 mRNA明显高与正常对照组、甲氨蝶呤治疗组、BMSCs移植治疗组(P＜0.05);而BMSCs移植治疗组与甲氨蝶呤治疗组有显著性差异(P＜0.05)，与正常对照组无显著性差异(P＞0.05)。

图1 RNA质量鉴定Fig.1 RNA quality identification

2.4 各组灰度值的比较 β-actin灰度值结果显示(见表1):BMSCs移植治疗组与正常对照组无统计学差异(P＞0.05);CIA模型组小鼠与正常对照组比较有统计学差异(P＜0.05);甲氨蝶呤治疗组与CIA模型组小鼠比较有统计学差异(P＜0.05);而BMSCs移植治疗组与甲氨蝶呤治疗组有显著性差异(P＜0.05)。

图2 各组组织中MMP-2 mRNA的表达结果Fig.2 The expression of MMP-2 mRNA in each organization

图3 各组组织中MMP-9 mRNA的表达结果Fig.3 The expression of MMP-9 mRNA in each organization

表1 各基因组灰度值比β-actin灰度值(μmol/L)Tab.1 The ratio of gray value genome and β-actin(μmol/L)

3 讨论

MMPs是一类含有锌原子，其活性依赖于钙原子的肽链内切酶，大都以潜酶形式分泌。MMP-2和MMP-9是其中一大类，又名明胶酶，相对分子质量分别为72 000、95 000。由于其是构成细胞外基质(Extracellular matrix，ECM)降解最重要的酶系统，参与EMC的重塑、炎症反应、免疫应答等[1]，近几年成为研究热点。

MMPs对细胞外基质EMC的降解是RA患者关节破坏的必要环节[2，3]。近年发现RA患者的滑液及外周血中 MMP-2，MMP-9 水平均增高[4，5]。Uchibori等[6]对关节炎模型小鼠研究也证明 MMP-2、MMP-9在关节炎的发病中起一定作用。我们的测定表明，RA患者血清中MMP-2、MMP-9水平显著高于健康对照，提示血清MMP-2、MMP-9水平与RA病情活动相关，在RA的骨破坏中可能起作用。Makowski等[7]揭示MMP-9与抗-双链DNA呈负相关，在抗体沉积在组织期间，对监测SLE疾病的活动非常重要。Derosa等[8]发现酶谱分析是检查MMPs水平的精确方法，当MMPs的量高于400 pg，其活性才能被检测，其表达量与其活性的比率为7∶1。因此，该实验不仅用于定量检测酶的总量，而且还可检测酶量与活性的比例，这使得酶谱不同于 ELISA，ELISA不能分辨酶的活性和非活性形式[9]。而酶谱结果能够反映研究对象的MMPs活性，通过研究MMPs的表达水平和活性，MMPs在RA和SLE中作用能较清楚地反映出来。在正常的人体组织中，MMPs的表达较低，但在一定的病理过程中其表达水平可升高。细胞外信号，包括细胞因子、生长因子和直接的细胞与细胞之间的接触能瞬时刺激MMPs蛋白的合成[1]。SLE是一种自身免疫性疾病，其特征是以Th2细胞介导的体液免疫反应为主，而RA则是以Th1细胞介导的细胞免疫反应为主。鉴定为什么这两种不同免疫反应的患者血清中MMP-2和MMP-9显著增加的机制是非常有意义的。一种可能的解释是:不管在RA或SLE中，免疫反应过程中核转录因子(NF-κB)组成式激活，上调各种细胞因子的转录活性，提高炎性反应的细胞因子接着刺激MMPs的表达和活性[1]。但是，这种解释需要进一步研究。总之，RA和SLE患者血清中MMP-2和MMP-9的表达水平和活性显著升高，因此MMPs蛋白在自身免疫性疾病中起一定的作用，可作为该类疾病的一种辅助检测指标。

本研究通过RT-PCR法检测和凝胶图像分析结果显示在CIA小鼠脾组织中MMP-2和MMP-9的表达明显增加。这点与别的文献报道一致[10]。而经过BMSCs移植治疗后MMP-2和MMP-9的表达明显下降，统计学处理有显著性差异(P＜0.05)，从而证明BMSCs对CIA小鼠移植治疗后MMP-2和MMP-9有免疫调节作用。本实验也说明BMSCs可以通过调控MMP-2、MMP-9 mRNA表达，参与RA软骨的病理变化过程及软骨ECM的合成，维持软骨ECM中胶原纤维网络构架，可有效地治疗RA，并改善其临床症状，是一种很有前途的生物治疗方法。

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3 Gaye C，Oliver F G，Charlotte B et al.Early joint erosions and serum levels of matrix metalloproteinase 1，matrix metalloproteinase 3，and tissue inhibitor of metalloproteinases 1 in rheumatoid arthritis[J].Arthritis Rheum，2001;44(10):2263-2274.

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7 Makowski G S，Ramsby M L.Concentrations of circulating matrix metalloproteinase 9 inversely correlate with autoimmune antibodies to double stranded DNA:implications form onitoring disease activity in systemic lupus erythematosus[J].Mol Pathol，2003;56(4):244-247.

8 Derosa G，Avanzini M A，Geroldi D et al.Matrix metalloproteinase maybe a marker of microangiopathyin children and adolescents with type 1 diabetes mellitus[J].Diabetes Res Clin Pract，2005;70(2):119-125.

9 Kleiner E D，Stetler-Stevenson W G.Quantitative zym o-graphy:detection of picogram quantities of gelatinases[J].Anal Biochem，1994;218(2):325-329.

10 Ainiala H，Hietaharju A，Dastidar P et al.Increased serum matrix metalloproteinase 9 levels in systemic lupus erythematosus patients with neuropsychiatric manifestations and brain magnetic resonance imaging abnormalities[J].Arthritis Rheum，2004;50(3):858-865.