CD20+细胞与急性移植肾细胞性排斥反应及预后的关系

文吉秋 陈劲松 季曙明 陈惠萍 孙启全 程东瑞 刘志红

肾移植术后急性排斥反应仍然是影响移植肾预后的一个重要因素。Sarwal等［1］首次提出肾移植急性排斥反应组织中CD20+细胞浸润是判断移植肾急性排斥反应预后不良的重要因素。随后很多研究证实了这个观点［2－4］，近期研究发现CD38+B淋巴细胞联合CD20+细胞是移植肾预后较差的指标［5］，抗CD20单克隆抗体可以有效治疗移植肾难治性排斥反应，并取得了较好效果［6，7］。然而也有学者认为移植肾急性排斥反应中CD20淋巴细胞聚集与移植肾预后无相关性［8－10］。迄今为止，CD20淋巴细胞聚集与移植肾预后的关系还存在争议。

既往研究显示，移植肾急性排斥反应中CD20+细胞浸润是预后不良的标志，同时发现CD20+细胞聚集较多的患者急性排斥反应发生时间晚于CD20+细胞聚集较少者［11］，这与此后的研究结论相一致［12］。本研究回顾性分析了不同时期急性细胞性排斥反应中各种不同类型浸润细胞的分布特点，特别关注在不同时期发生的急性细胞性排斥反应中CD20+细胞聚集与移植肾预后之间的关系。

对象和方法

研究对象 2003年5月～2008年12月在南京军区南京总医院全军肾脏病研究所行同种异体肾移植并经移植肾活检诊断急性细胞性排斥反应患者55例(符合Banff 97标准IA，IB和ⅡA级)，肾组织C4d免疫荧光染色均为阴性［13］。入选患者根据排斥反应和肾活检时间分为3组［14］:极早期排斥反应组17例(极早期组，＜2周)，早期排斥反应组16例(早期组，2周～6月)和晚期排斥反应组22例(晚期组，＞6月)。

治疗和随访 患者均接受抗CD25单克隆抗体诱导治疗(赛尼哌或舒莱)，维持性免疫抑制剂方案包括神经钙蛋白抑制剂(他克莫司或者环孢素)，抗增生药物(霉酚酸酯或咪唑立宾)和泼尼松。在诊断为急性细胞排斥反应后均接受积极的免疫抑制治疗，首先予甲泼尼龙500mg冲击治疗3d，之后泼尼松逐渐减至维持剂量。甲泼尼龙冲击治疗后3d内血清肌酐(SCr)无下降者定义为激素耐药［2］，加用免疫吸附等强化治疗。患者随访中位期为48月。

肾活检 移植肾活检在B超引导下实行实时穿刺，穿刺针为18G，采用负压吸引穿刺法，取得肾组织符合Banff规定的要求［13］。

光镜 用石蜡切片行HE、PAS和PASM染色，并在尼康8100显微镜下观察。其中肾小球炎、间质细胞浸润、动脉内膜炎、肾小管炎采等反应急性排斥反应的指标采用Banff 97方法进行积分。

免疫荧光 应用冰冻组织切片行 IgA，IgG，IgM，C3，C4和 C4d染色。

免疫组织化学 应用石蜡切片免疫组织化学Envision两步法:石蜡切片脱蜡至水，用3%过氧化氢抑制内源性过氧化物酶后，用1 ml EDTA溶液经高压锅修复抗原，用正常10%小牛血清封闭，经洗涤后分别加入单克隆鼠抗人CD20抗体(1∶100)和HLA-DR 抗体(1∶50)，CD68(1∶100)，CD4(1∶100)，CD8(1∶100)室温孵育2h后，再加入Envision室温孵育40 min，DAB 显色5 min，苏木素复染2 mins，烘干，中性树胶封片。尼康8100显微镜下观察［15］。HLA-DR判断标准是计算阳性表达小管的百分比，用百分数来表示［15］。

细胞密度计算方法 由不知情临床资料的病理医生读片，随机选取16个高倍视野，计算每个视野内的细胞数，总和为细胞密度(个/mm2)。根据细胞密度的中位数来判定高密度和低密度组。

观察内容 首先比较各组之间临床资料和CD20+，CD4，CD8，CD68 细胞密度以及 HLA-DR 表达的差别，以及不同时期排斥反应临床特征和各种细胞密度分布特点。然后对所有入选患者根据CD20+细胞密度分为高密度组和低密度组，比较两组之间CD68，CD4，CD8细胞密度以及HLA-DR表达的差别和移植肾存活率有无差别。再对两周后发生的急性细胞性排斥反应受者根据CD20+细胞密度分为高密度组和低密度组，比较两组之间的移植肾存活率。

统计学分析 采用SPSS13.0统计软件进行数据分析，所有计数资料用均数±标准差表示，三组之间率的差别应用Fisher’s精确概率计算，两组间一致性比较应用方差分析。生存分析运用Kaplan-Meier生存分析法和Log-Rank方法。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一般情况 三组患者性别比、供者类型，术前群体反应性抗体水平、SCr、冷热缺血时间和Banff病理分级之间差别无统计学意义(表1)，但极早期组耐激素比例和移植肾丢失率均低于早期和晚期组。

表1 不同时期急性排斥反应患者的临床特征

不同时期急性排斥反应组织浸润细胞的差别极早期CD20+细胞密度低于早期组和晚期组，而CD4，CD8，CD68密度和肾小管 HLA-DR表达在三组之间无明显差别。进一步计算发现，极早期组(CD4+CD8)/CD20比值明显高于早期和晚期排斥反应组(表2)。

表2 不同时间急性排斥反应组浸润细胞和小管HLA-DR表达的差别

CD20+细胞密度与移植肾预后的关系 所有入选患者按CD20+细胞密度中位数(168个/mm2)分为高密度组和低密度组。高密度组激素耐药的比例高于低密度组(12/28 vs 4/27，P＜0.05)，Kaplan-Meier生存分析法显示，CD20+细胞高密度组生存率低于低密度组(P＜0.05)(图1)。

为排除其他因素对预后判断的影响，对比CD20+细胞高密度组和低密度组的其他病理特点发现，肾小球炎、间质细胞浸润和动脉内膜炎无明显差别，其他浸润细胞(CD4、CD8、CD68)和肾小管HLA-DR表达亦无明显差别(表3)。CD20+细胞高密度组肾小管炎程度高于低密度组(P＜0.05)，而肾小管炎发生率无明显差别(均为100%)。进一步对比发现，在CD20+细胞低密度组两周内急性排斥反应比例明显偏高(14/27 vs 2/18 P＜0.05)。

图1 CD20+细胞高密度组和低密度组生存率分析

表3 CD20+细胞低密度组和高密度组病理特点

2周以后急性细胞性排斥反应组CD20+细胞密度与移植肾预后的关系 考虑到极早期急性排斥反应预后好(表1)，而在此期内发生的急性排斥反应CD20+细胞浸润较少(表2)。为避免排斥反应发生时间干扰CD20+细胞密度与移植肾生存率的关系，对肾移植术两周后发生急性排斥的患者，依据该组CD20+细胞密度的中位数(≥224/mm2)分为CD20+细胞高密度组和低密度组，两组之间耐激素比例无差别(8/19 vs6/19，P＞0.05)，移植肾生存率也无明显差别(P＞0.05)(图2)。

图2 两周后发生的急性细胞性排斥反应不同CD20+细胞组移植肾生存率

讨 论

CD20+细胞浸润和排斥反应发生时间的关系我们既往研究证实CD20+细胞聚集是移植肾预后不良的指标［11］，与 Sarwal最初的结论一致［1］，但又不同于后续有关 CD20+细胞浸润和预后的报道［8－10］。这些研究结果之所以存在差别，笔者认为主要与CD20+细胞浸润程度的判断标准、入选病例排斥反应发生的时间及随访时间等因素有关，这些因素的变异导致了结果的不确定性。本研究观察了CD20+细胞在不同时期细胞性排斥反应中的分布特点，并进一步证实在移植肾急性排斥反应中CD20+细胞浸润和预后的关系。

我们前期研究发现，CD20+细胞高密度组急性排斥反应发生时间较晚［(145.4±121.2)d vs(75.4 ±108.8)d，P ＞0.05］［11］，提示 CD20+细胞浸润可能与移植肾急性排斥反应发生时间有关，在移植后两周内发生急性细胞性排斥反应者少有CD20+细胞聚集，而以其他单个核细胞浸润为主(如CD4、CD8和CD68等)(表2)。但两周后发生的急性排斥反应中，部分患者已有CD20+细胞聚集，在超过6月的排斥反应中，CD20+细胞浸润聚集发生率更高。而CD4、CD8和CD68细胞浸润程度和排斥反应发生的时间无此规律。

CD20+细胞浸润和移植肾预后的关系 在Sarwal最初的研究中采用定量法来计算CD20+细胞浸润密度［1］，分为高密度组(＞250个/mm2)和低密度组(＜100个/mm2)。本研究是参照Sarwal最初提出的定量计算法来计算CD20+细胞密度，与之不同的是将所有患者根据CD20+细胞密度中位数分为高密度和低密度组。因此相对于所有急性排斥反应患者，CD20+细胞密度中位数为168个/mm2。而肾移植术后两周以后的急性排斥患者，CD20+细胞密度的中位数为224个/mm2。此举的目的是为了对比不同时期细胞密度的差别。我们采用的定量法与其他学者提出的半定量计数法也具有良好的一致性［13］。因此我们认为此法具有科学性和可重复性，尤其是病理医生对于临床资料的双盲更加保证了结果的准确性。

根据CD20+细胞浸润密度中位数将入选患者分为高密度组和低密度组结果显示，两组间近期和远期预后均较差，其中高密度组耐激素的比例高于低密度组，高密度组生存率低于低密度组这个结论与以前的某些研究结果相一致［2－4］。而对两周后发生的急性细胞性排斥反应进行分析发现，CD20+细胞高密度组和低密度组之间耐激素比例和移植肾生存率也无明显差别，这个结论与既往某些研究有存在一致性［9，10］。

之所以出现上述不同结果，其可能原因在于极早期急性排斥组预后相对较好，而两周后发生的排斥反应近期和远期预后均相对较差(表1)，这与以往文献报道一致［15－18］。而本研究发现在极早期发生的急性细胞性排斥反应中很少有CD20+细胞，因此极早期排斥反应受者大部分为CD20+细胞低密度组。对所有排斥反应进行分析时，低密度患者中纳入了大部分极早期患者，而这部分患者预后较好导致低密度组预后较好。进一步分析发现高密度组和低密度组之间 CD4，CD8，CD68细胞密度，HLADR表达，细胞浸润程度，肾小球炎及动脉内膜炎均无差别，但是肾小管炎在CD20+细胞高密度组较为明显，但是发生率无明显差别(表3)。由以上资料得出，单纯CD20+细胞密度不是判断移植肾预后的指标，而是与发生排斥反应的时间有很大联系，这也恰好解释了先前不同研究结论之间的差异。

其他表型B淋巴细胞和急性排斥反应预后之间的关系 CD20+细胞在移植肾中浸润与抗体产生无关［15］。Zarkhin等［12］研究认为 CD20+细胞在移植肾排斥反应中可能参与抗原递呈作用，与抗体产生无关，而 CD20+细胞进一步分化为 CD38+和CD138+阳性B淋巴细胞可能与抗体产生有关，但是此结论需要进一步证实，极早期发生的急性排斥反应无需CD20+细胞参与，在两周后发生急性排斥中CD20+细胞参与抗原递呈，而晚期CD20+细胞转化为CD38+和CD138+阳性B淋巴细胞，参与体液性排斥反应，该假说需要进一步证实。

但是，目前的研究结论认为CD20+细胞在移植肾中浸润与抗体产生无关是基于现有经典的体液性排斥反应标准，而新近的研究发现经典体液性排斥反应标准存在敏感性低而特异性高的缺点，认为C4d在管周毛细血管的沉积诊断体液性排斥反应可能是敏感性低而特异性高，可能会漏诊某些病例，并提出了诊断体液性排斥反应的新标准［19，20］，但尚未得到认同，需要进一步研究来证实。

小结:在两周内发生的急性排斥反应中有多种单个核细胞浸润，但少有CD20+细胞聚集，两周后发生的急性细胞性排斥反应中，CD20+细胞浸润程度与预后无关。而整体急性细胞性排斥反应中，CD20+细胞低密度组的患者预后较好，可能与低密度组中极早期排斥反应比例较高有关。

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