重症急性胰腺炎脑损伤时海马神经元凋亡与核转录因子-κB的关系

袁伟燕 周国雄 黄华 许海玲 黄中伟

·论著·

重症急性胰腺炎脑损伤时海马神经元凋亡与核转录因子-κB的关系

袁伟燕 周国雄 黄华 许海玲 黄中伟

目的探讨急性坏死性胰腺炎(ANP)大鼠合并脑损伤时脑组织海马神经元凋亡及其与NF-κB p65之间的关系。方法64只SD大鼠按数字表法随机分为生理盐水(NS)组和ANP组。胰胆管逆行注入4%牛磺胆酸钠制备ANP模型。尼氏染色法检测脑组织海马神经元的损伤，TUNEL法检测神经元凋亡，RT-PCR法及免疫组化法检测海马组织NF-κB p65 mRNA 和蛋白的表达。结果ANP组大鼠海马神经元缺失，胞核固缩，核仁欠清晰，尼氏小体减少或消失，损伤随时间延长逐渐加重。ANP组大鼠制模后3、6、12 h的神经元凋亡指数分别为10.63±0.24、21.02±0.25、17.12±0.36，显著高于NS组同时点的0.33±0.19、0.71±0.67、0.45±0.33(P值均<0.01)；NF-κB p65 mRNA表达量分别为0.63±0.05、1.05±0.06、0.92±0.05，显著高于NS组同时点的0.11±0.01、0.12±0.01、0.08±0.01(P值均<0.05)。NF-κB p65蛋白的变化与其mRNA的变化一致。结论ANP大鼠脑损伤的早、中期与神经元凋亡关系密切，其机制可能与NF-κB p65的激活有关。

胰腺炎，急性坏死性； 脑损伤； 神经元； 细胞凋亡； 核转录因子-κB

重症急性胰腺炎(SAP)是消化内科常见急重症之一，常常并发多脏器功能不全，脑损伤也是常见的并发症之一。胰性脑病病情凶险，目前尚无有效的诊疗方法，对其发病机制亦未能完全了解。本实验检测急性坏死性胰腺炎(ANP)大鼠合并脑损伤时脑组织海马神经元的凋亡及NF-κB p65的表达，分析它们之间的关系。

材料与方法

一、实验动物分组及模型制备

健康雄性清洁级SD大鼠64只，体重260～300 g，由南通大学医学院动物实验中心提供。按数字表法随机分为生理盐水(NS)组和ANP组，每组32只。胆胰管内逆行注入4%牛磺胆酸钠(Sigma公司)0.1 ml/100 g体重的方法制备ANP模型，NS组逆行注入等量的无菌生理盐水。制模后0、3、6、12 h分批处死8只大鼠，取血液、胰腺及海马组织。胰腺组织置4%多聚甲醛固定；大脑海马组织部分置4%多聚甲醛固定，部分立刻置液氮冷冻，-80℃冰箱保存。

二、血清淀粉酶测定

采用酶法，由美国Vitros-250型全自动生化分析仪测定。

三、胰腺组织病理学检查及评分

固定的胰头部组织常规切片，HE染色，由病理科医师阅片，按Rongione等[1]标准进行病理评分。

四、海马尼氏染色

固定的海马组织常规石蜡包埋、切片，置室温30 min，蒸馏水冲洗后放入预热50℃的1%甲苯胺蓝水溶液中，置56℃温箱染色20 min，冲洗后乙醇分化、脱水、二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察神经元。细胞核呈淡蓝色，尼氏小体呈深蓝色。

五、海马神经元凋亡指数测定

采用TUNEL法，按TUNEL试剂盒(德国MERCK公司)说明书操作。使用Image Pro Plus 5.1图像分析软件分析结果，凋亡指数(AI)=凋亡细胞数/细胞总数×100%。

六、海马组织NF-κB p65蛋白检测

采用免疫组化SP法。抗NF-κB p65一抗(Santa Cruz公司)工作浓度为1∶100，以PBS代替一抗作为阴性对照。结果判定：锥体细胞的胞核及胞质内出现棕黄色颗粒为阳性细胞。

七、海马组织NF-κB p65 mRNA检测

为保证钢纤维混凝土施工质量，必须结合工程实际进行钢纤维混凝土配合比设计和几何参数的确定，钢纤维增强效果与长度、等效直径和长径比等参数有关，随长径比的增大钢纤维增强作用随之增加，长度太短起不到增强作用，太长则会增加施工难度，长径比过大将影响拌和物质量，过小则容易在拌和过程中折弯。钢纤维材料必须与基材相适应，抗拉强度保持在至少500MPa，钢纤维混凝土设计过程中重点考虑钢纤维的等效直径和长径比，如表1所示，本工程钢纤维等效直径控制在0.55mm以上。

以Trizol试剂提取总RNA，逆转录合成cDNA。取2 μl cDNA行PCR扩增。NF-κB p65上游引物5′-GACCTGGAGCAAGCCATTAG-3′，下游引物5′-ATCAGAAGGCCGCCGAAGC-3′，扩增片段459 bp；内参GAPDH上游引物5′-TGATGACATCAAGAA-GGTGGTGAAG-3′，下游引物5′-TCCTTGGAGGCC-ATGTGGGCCAT-3′，扩增片段240 bp。PCR反应条件：94℃ 4 min，94℃ 40 s、58℃ 40 s、72℃ 45 s, 35个循环，最后72℃ 7 min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，凝胶成像系统扫描，以NF-κB p65与GAPDH灰度比值表示NF-κB p65 mRNA相对表达量。

八、统计学处理

结 果

一、血清淀粉酶含量

制模后0、3、6、12 h NS组血清淀粉酶含量分别为(1954±112)U/L、(3390±226)U/L、(2362±261)U/L、(2073±155)U/L；ANP组分别为(2684±126)U/L、(7758±270)U/L、(11648±858)U/L、(9851±238)U/L。ANP组各时间点的血清淀粉酶含量均显著高于NS组(P值均 <0.05)。

二、胰腺组织病理学变化

NS组大鼠胰腺无明显损伤，制模后0、3、6、12 h的病理分值分别为0.41±0.16、0.51±0.31、0.58±0.33、0.68±0.12；ANP组6 h后见大量炎性细胞浸润，片状出血，胰腺小叶结构破坏，大量腺泡细胞坏死(图1)，制模后0、3、6、12 h的病理分值分别为2.15±0.35、3.49±0.85、4.28±0.52、6.39±1.71，均显著高于同时间点的NS组(P值均 <0.05)。

三、海马神经元的变化

NS组海马区锥体细胞排列整齐致密，核大而圆，核仁明显，尼氏小体丰富。ANP组可见锥体细胞缺失，残留细胞排列不规则，胞核固缩，核仁欠清晰，尼氏小体减少或消失，海马神经元损伤随时间延长逐渐加重(图2)。

图1ANP组6 h的胰腺病理改变(HE ×125)图2ANP组12 h海马的神经元改变(尼氏染色 ×200)

四、海马神经元的凋亡

NS组偶可见凋亡细胞(图3a)。ANP组0 h有少量凋亡细胞，6 h凋亡细胞最多(图3b)。制模后0、3、6、12 h NS组AI分别为0.22±0.13、0.33±0.19、0.71±0.67、0.45±0.33；ANP组AI分别为4.28±0.14、10.63±0.24、21.02±0.25、17.12±0.36，较NS组显著增加(P值均<0.01)。

图3NS组(a)和ANP组(b)6 h时海马的凋亡神经元(TUNEL ×200)

五、海马组织NF-κB p65蛋白表达

NS组偶见少量锥体细胞有NF-κB p65蛋白表达，主要位于胞质(图4a)，且表达较弱。ANP组锥体细胞NF-κB p65蛋白表达增加，主要位于胞核(图4b)，于6 h达高峰。

图4NS组(a)和ANP组(b)6 h时海马组织NF-κB蛋白表达(免疫组化 ×100)

六、海马组织NF-κB p65 mRNA表达

NS组海马组织NF-κBp65 mRNA表达极弱，制模后0、3、6、12 h的表达量分别为0.10±0.03、0.11±0.01、0.12±0.01、0.08±0.01。ANP组海马组织NF-κB p65 mRNA表达增加，6 h达高峰(图5)，制模后0、3、6、12 h的NF-κB p65 mRNA表达量分别为0.24±0.04、0.63±0.05、1.05±0.06、0.92±0.05，较NS组各时间点显著增强(P值均<0.05)。

M：标准参照物；1、2、3、4分别为ANP组 0、3、6、12 h点；5：NS组 6 h点

图5海马组织NF-κB p65 mRNA 的表达

讨 论

Menza等[2]研究认为，胰性脑病的发生与胰酶对中枢神经系统的损伤有关。赵海平等[3]研究认为，实验性ANP并脑损伤的发生发展与细胞因子和炎症介质，如TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8等有关。

NF-κB在机体的免疫、炎症反应及凋亡调控等方面发挥着重要作用[4]，它能刺激IL-1β转化酶蛋白、c-myc、TNF-α、CED基因的表达[5]。NF-κB在脑组织内的活性相对高于其他组织[6]，在神经系统炎症、缺血、损伤等疾病中均存在NF-κB的激活[7]。

本实验结果显示，ANP组随时间延长海马神经元损伤逐渐加重，细胞凋亡显著增加，NF-κB p65表达显著增强，并均于6 h达高峰，12 h时略有减少，表明NF-κB p65在牛磺胆酸钠诱导的ANP并脑损伤的发生、发展过程中通过促进细胞凋亡来加重神经元损伤。NF-κB p65在ANP并脑损伤的早、中期作用较晚期明显，提示晚期脑损伤除了与NF-κB激活及细胞凋亡有关外，还可能有其他一些因素的参与。

[1] Rongione AJ, Kusske AM, Ashley SW, et al. Interleukin 10 reduces the severity of acute pancreatitis in rats.Gastroenterology,1997,112:960-967.

[2] Menza MA，Murraay GB.Pancreatic encephalopathy.Biol Psychiatry，1989，25：781-784.

[3] 赵海平，吕飞飞，欧阳晓晖.丙二醛、超氧化物歧化酶及肿瘤坏死因子-α在大鼠实验性胰性脑病中的作用.中国普外基础与临床杂志.2008,15:337-341.

[4] 刘玲.NF-κB的活化与神经细胞凋亡.国外医学,2003,23:621-623.

[5] 陶陆阳，丁梅. 大鼠脑挫伤后NF-kB表达的分子生物学研究. 法医学杂志.2004,5:73-80.

[6] O′Neill LA,Kaltschmidt C.NF-kappa B:a crucial transcription factor for glial and neuronal cell function.Trends Neurosci,1997,20: 252-258.

[7] Zhu Y,Culmsee C,Klumpp S,et al.Neuroprotection by transforming growth factor-beta 1 involves activation of nuclear factor-kappaB through phosphatidylinositol-3-OH kinase/Akt and mitogen activated protein kinase-extracellular signal tegulated kinase 1,2 signaling pathways.Neuroscience,2004,123:897-906.

2010-09-13)

(本文编辑：屠振兴)

HippocampalneuronalapoptosisandnuclearfactorκBexpressioninratswithacutenecrotizingpancreatitiswithbraininjury

YUANWei-yan,ZHOUGuo-xiong,HUANGHua,XUHai-ling,HUANGZhong-wei.

DepartmentofGastroenterology,AffiliatedHospital,NantongUniversity,Nantong226001,China

HUANGZhong-Wei,Email：yuanweiyan77@tom.com

ObjectiveTo investigate the relationship between expression of nuclear factor kappa B p65 (NF-κB p65) and hippocampal neuronal apoptosis in acute necrotizing pancreatitis (ANP) rats with brain injury.MethodsSixty-four SD rats were randomized into normal saline group (NS) and ANP group. The ANP rat model was induced by retrograde injection of 4% sodium taurocholate into the pancreaticobiliary duct of SD rats. Nissle stain was used to detect the brain injury. Neuronal apoptosis was determined by TUNEL. NF-κB p65 expression was detected by immunohistochemistry and RT-PCR.ResultsHippocampal neuron was absent, karyopyknosis, unclear nucleolus and decreased Nissl bodies were found, the injuries was aggravated with time. The apoptosis index at the 3, 6 and 12 h in ANP group was 10.63±0.24, 21.02±0.25, 17.12±0.36,respectively, while they were 0.33±0.19, 0.71±0.67, 0.45±0.33 in NS group, and the difference was statistically significant (P<0.01). The expressions of NF-κB p65 mRNA were 0.63±0.05,1.05±0.06,0.92±0.05, which were significantly higher than those in the NS group (0.11±0.01,0.12±0.01,0.08±0.01,P<0.05). The change of expression of NF-κB p65 protein was consistent with that of NF-κB p65 mRNA.ConclusionsThe brain injury of ANP rats was highly correlated with neuronal apoptosis at the early and middle phase of ANP, and its mechanism may be related with NF-κB p65 activation.

Pancreatitis,acute necrotizing; Brain injury; Neurons; Apoptosis; Nuclear factor-κB

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.02.014

226001 江苏南通，南通大学附属医院消化内科

黄中伟，Email:yuanweiyan77@tom.com