内分泌腺来源的血管内皮生长因子对胰腺癌MiaPaCaⅡ细胞恶性表型的调控作用

郭晓钟 任丽楠 刘旭 刘峰 邹德莉

·论著·

内分泌腺来源的血管内皮生长因子对胰腺癌MiaPaCaⅡ细胞恶性表型的调控作用

郭晓钟 任丽楠 刘旭 刘峰 邹德莉

目的探讨内分泌腺来源的血管内皮生长因子(EG-VEGF)对胰腺癌细胞MiaPaCaⅡ增殖、迁移和凋亡等的影响。方法应用100、200 ng/ml EG-VEGF处理MiaPaCaⅡ细胞24、48、72、96 h，采用MTT方法检测细胞增殖，细胞划痕实验法检测细胞爬行距离百分比，流式细胞仪检测细胞凋亡。结果经0、100、200 ng/ml EG-VEGF处理72 h后，MiaPaCaⅡ细胞的增殖分别为0.253±0.012、0.374±0.013、0.383±0.015，EG-VEGF显著促进MiaPaCaⅡ细胞的增殖(P<0.05)。0、100 ng/ml EG-VEGF处理24 h后，MiaPaCaⅡ细胞爬行距离百分比分别为(39.0±2.7)%和(79.0±5.4)%(P<0.05)；细胞凋亡率分别为(27.40±3.45)%和(13.21±4.65)%(P<0.05)。结论EG-VEGF可明显促进MiaPaCaⅡ细胞增殖和迁移，抑制其凋亡。

胰腺肿瘤； 血管内皮生长因子； 表型

胰腺癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一，早期诊断十分困难，预后极差，一旦确诊其手术切除机会仅10%～15%，总体术后5年生存率1%～4%左右，因此寻找切实可行的诊治方法对胰腺癌诊治尤为重要。

内分泌腺来源的血管内皮生长因子(endocrine glands-derived vascular endothelial growth factor，EG-VEGF，又称PK1)是近年来发现的具有组织特异性的血管内皮生长因子，已经发现其在结直肠癌和前列腺癌等多种类固醇相关的肿瘤组织中有表达，且可调控肿瘤细胞的生物学功能。EG-VEGF对胰腺癌细胞是否存在调控作用目前尚无文献报道。因此，本实验旨在探讨EG-VEGF对人胰腺癌细胞恶性表型的调控作用。

材料和方法

一、MTT法检测胰腺癌细胞的增殖

人胰腺癌高转移细胞系MiaPaCaⅡ由本实验室保存。取对数生长期细胞，以1.5×103个/孔接种于96孔板中，分为对照组、EG-VEGF(Peprotech 公司) 100 ng/ml和200 ng/ml组，每组3个复孔。常规培养细胞4 h后，更换培养基，分别加入0、100、200 ng/ml的EG-VEGF继续培养24、48、72、96 h，每孔加入5 g/L MTT(Sigma公司)20 μl，继续培养4 h，弃上清，加150 μl DMSO，震荡10 min，酶标仪上测各孔490 nm波长吸光度值(A490)，以单纯培养液调零。

二、划痕实验检测胰腺癌细胞的迁移

取对数生长期细胞接种于6孔板中，分为对照组和100 ng/ml EG-VEGF组，每组设3个复孔。待细胞长满瓶底时，取黄色枪尖垂直瓶底制造人工划痕，拍照并记录初始划痕距离，更换细胞培养液去除脱落细胞，分别加入0、100 ng/ml的EG-VEGF，24 h后观察细胞爬行距离。细胞爬行距离百分比=细胞爬行的距离/初始划痕距离×100%

三、流式细胞仪检测细胞凋亡

细胞以无血清DMEM培养过夜，再在培养上清中分别加入0、100 ng/ml的EG-VEGF，24 h后收集培养上清及贴壁细胞，4℃ PBS重悬细胞，按照细胞凋亡检测试剂盒说明书进行Annexin Ⅴ染色，流式细胞仪收集10 000个细胞，测细胞凋亡率。凋亡率=(早期凋亡细胞+ 晚期凋亡细胞)/总细胞数×100%。

四、统计学处理

结 果

一、EG-VEGF对MiaPaCaⅡ细胞增殖的影响

经100、200 ng/ml EG-VEGF处理72 h后，A490值分别为0.374±0.013和0.383±0.015，较未经处理组的0.253±0.012有显著增高(P值均<0.05)，但两种浓度间对细胞增殖的影响无显著差异(图 1)。

二、EG-VEGF对MiaPaCaⅡ细胞迁移的影响

0、100 ng/ml EG-VEGF处理细胞24 h后，细胞爬行距离百分比分别为(39.0±2.7)%和(79.0±5.4)%，两组差异具有统计学意义(P<0.05，图2)。

图1 EG-VEGF对MiaPaCaⅡ细胞增殖的影响

图2EG-VEGF对MiaPaCaⅡ细胞迁移能力的影响(实线为初始划痕距离，虚线为24 h后细胞迁移距离)

三、EG-VEGF对MiaPaCaⅡ细胞凋亡的影响

0、100 ng/ml EG-VEGF处理24 h后，细胞凋亡率分别为(27.40±3.45)%和(13.21±4.65)%，两组差异具有统计学意义(P<0.05，图 3)。

图3 MiaPaCaⅡ细胞的凋亡检测图

肿瘤是在各种致瘤因素作用下因基因调控失调导致细胞异常增生而形成的。肿瘤的发生和发展以及演变是受到多种因素调控的复杂过程。细胞因子能在细胞间传递信息，通过促进细胞黏附、血管生成和细胞外基质的降解等多种途径参与肿瘤的形成，并促进细胞增殖和浸润转移。但这些细胞因子缺乏组织特异性，故在治疗过程中受到一定的限制。

EG-VEGF是2001年被确认的组织特异性的血管内皮生长因子[1]，它特异地作用于生成类固醇的内分泌腺的内皮组织，如卵巢、胎盘、肾上腺等，可诱导血管内皮细胞增殖和迁移。目前研究表明，EG-VEGF对多种肿瘤的生长、凋亡和转移发挥重要的调控作用[2-7]。胰腺细胞也具有合成类固醇的能力。有文献初步显示，EG-VEGF主要分布在男性的胰岛部位和女性的外分泌部位，其表达水平由高到低依次为女性胰腺癌患者、男性胰腺癌患者、正常女性、正常男性[8-9]。Goi等[4]报道，EG-VEGF可促进结肠癌细胞的浸润和转移以及血管生成。本结果显示，重组人EG-VEGF可在一定范围内促进胰腺癌细胞的增殖，促进癌细胞的迁移，抑制癌细胞的凋亡，一定程度上调控胰腺癌细胞的恶性表型，提示EG-VEGF在胰腺癌的生长过程中具有重要的调控作用。

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2010-07-28)

(本文编辑：屠振兴)

MalignantphenotyperegulatedbyendocrineglandsderivedVEGFinpancreaticcancercellsMiaPaCaⅡ

GUOXiao-zhong,RENLi-nan,LIUXu,LIUFeng,ZOUDe-li.

DepartmentofGastreonterology,GeneralHospitalofShenyangMilitaryCommend,Shenyang110840,China

GuoXiao-zhong,Email:guoxiaozhong1962@163.com

ObjectiveTo evaluate the endocrine glands derived VEGF(EG-VEGF) influence on growth, migration and apoptosis of pancreatic cancer cells MiaPaCaⅡ.MethodsMiaPaCaⅡ were treated by 100, 200 ng/ml EG-VEGF for 24, 48, 72, 96 h, and MTT assay was used to determine the proliferation; and cell scratch experiment was used to investigate the percentage of cell migration distance, flow cytometry was used to measure the apoptosis of the cancer cells.ResultsAfter MiaPaCaⅡ cells were treated by 0, 100, 200 ng/ml EG-VEGF for 72 h, the proliferation of MiaPaCaⅡ was 0.253±0.012,0.374±0.013,0.383±0.015, respectively EG-VEGF could significantly promote the proliferation of MiaPaCaⅡ(P<0.05). After MiaPaCaⅡ cells were treated by 0, 100 ng/ml EG-VEGF for 24 h, the percentage of cell migration distance was (27.40±3.45)% and (13.21±4.65)%,respectively with statistical difference (P<0.05),EG-VEGF could significantly promote the migration ability of MiaPaCaⅡ cells and inhibite the apoptosis.ConclusionsAfter EG-VEGF treatment, the growth and migration ability of MiaPaCaⅡ cells increases, apoptosis decreases.

Pancreatic neoplasms; Vascular endothelial growth factor; Phenotype

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.02.007

110840 沈阳，沈阳军区总医院消化内科

郭晓钟，Email:guoxiaozhong1962@163.com