阻断Hedgehog信号通路对人胰腺癌干细胞自我更新的影响

黄凤婷 张世能 梁爱心 峗淑莉 庄晓虹 陈文博

·论著·

阻断Hedgehog信号通路对人胰腺癌干细胞自我更新的影响

黄凤婷 张世能 梁爱心 峗淑莉 庄晓虹 陈文博

目的观察Hedgehog信号通路特异阻断剂环巴明对胰腺癌干细胞自我更新的影响。方法应用0.5、1、2、5、10 μmol/L环巴明处理胰腺癌PANC1干细胞、PANC1贴壁细胞和永生化胰腺导管上皮H6C7细胞 24、48、72 h。采用实时RT-PCR法检测细胞Smo及Gli1 mRNA表达；CCK-8法检测细胞增殖抑制；流式细胞仪检测细胞周期及凋亡。结果10 μmol/L环巴明处理72 h后，PANC1干细胞、PANC1细胞和H6C7细胞的Smo mRNA表达量分别为1、0.83、2.61； Gli1 mRNA为57.27、26.35、1；生长抑制率分别为(37.85±13.69)%、(8.53±4.43)%、(43.55±28.98)%。与PANC1细胞比较，PANC1干细胞的Smo、Gli1 mRNA 表达显著增加，生长抑制率亦显著增强(P值<0.05或<0.01)。经10 μmol/L环巴明处理72 h，PANC1干细胞G1期比例从(67.41±6.35)%显著降至(36.53±6.03)% (P<0.05)，细胞凋亡率从(10.95±5.68)%降至(5.73±1.42)% (P>0.05)；PANC1细胞G1期比例从(67.64±6.88)%显著降至(53.13±1.10)% (P<0.05)，细胞凋亡率从(12.08±4.12)%降至(5.66±1.33)% (P>0.05)；而H6C7细胞的G1期比例及凋亡无明显变化。结论环巴明阻断Hedgehog信号通路可抑制PANC1干细胞增殖，其机制可能与细胞凋亡无关。

胰腺肿瘤； 干细胞； Hedgehog信号通路； 自我更新

Hedgehog信号转导途径与胰腺胚胎发育密切相关，Bar等[1]和Zhao等[2]报道，脑胶质瘤干细胞等肿瘤干细胞中存在此通道，它与细胞自我更新和多向分化密切相关，而且与肿瘤的发生、发展有密切关系。我们的前期研究[3-4]已成功培养出具有肿瘤干细胞样特性的胰腺癌干细胞。本研究旨在观察环巴明(cyclopamine)特异阻断Hedgehog信号通路对人胰腺癌干细胞增殖、细胞周期及凋亡的的影响。

材料与方法

一、细胞株

人胰腺癌细胞系PANC1由中山大学附属第二医院消化内科实验室保存；永生化胰腺导管上皮细胞H6C7由加拿大安大略癌症研究所Tsao教授惠赠。PANC1常规培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基；H6C7培养于K-SFM混合培养基；PANC1细胞悬浮培养于含20 ng/ml EGF、5 μg/ml胰岛素、0.4%BSA、1∶50 B27的DMEM-F12(1∶1) 培养基中获得PANC1干细胞。

二、实时 RT-PCR检测细胞Smo、Gli1 mRNA

用Trizol法提取PANC1干细胞、PANC1贴壁细胞和H6C7的细胞总RNA，实时 RT-PCR检测细胞Smo、Gli1 mRNA表达，以18S rRNA为内参照。Smo上游引物5′-CATCCCTGACTGTGAGATCA-3′，下游引物5′-CACCATCTTGGTGACATGCT-3′，扩增片段370 bp；Gli1上游引物5′-CCATACATGTGTGAGCACGA-3′,下游引物5′-GGCACAGTCAGTCTGCTTT-3′，扩增片段308 bp。PCR仪为7300型(美国ABI公司)。RT反应条件：30℃ 10 min，42℃ 60 min，72℃ 10 min；PCR反应条件：95℃ 10 min，95℃ 10 s、60℃ 15 s、72℃ 30 s，40个循环，72℃延伸10 min。实验重复3次。相对表达量(RQ)=2-△△Ct。

三、CCK-8法检测细胞增殖

收集培养12～15 d的PANC1干细胞，消化成单细胞悬液，按每孔3×104个细胞接种于96孔板，立即分别加入到终浓度为0、0.5、1、2、5、10 μmol/L环巴明的培养基中常规培养。收集对数生长期PANC1贴壁细胞及H6C7细胞，按每孔3×103个细胞接种于96孔板培养24 h后，换含0、0.5、1、2、5、10 μmol/L环巴明的培养基常规培养。每组细胞均设2个复孔。三种细胞分别于培养24、48、72 h后每孔加入10 μl CCK-8试剂，继续孵育4 h，测吸光度值A450/A630比值，计算细胞增殖抑制率。抑制率(%)=(A对照组-A实验组)/A对照组×100%。

四、细胞周期检测

收集用10 μmol/L环巴明处理72 h的PANC1干细胞、PANC1贴壁细胞及H6C7细胞，消化成单细胞悬液，70%乙醇固定18 h，加入RNase至终浓度为50 μg/ml及PI染液至终浓度为50 μg/ml，37℃避光孵育30 min，应用流式细胞仪(FACSCalibur,美国Becton Dickinson公司)检测细胞周期。

五、细胞凋亡检测

收集用10 μmol/L环巴明处理72 h的PANC1干细胞、PANC1贴壁细胞及H6C7细胞，消化成单细胞悬液，1000 r/min离心5 min，弃上清，PBS洗2次，重悬细胞为106个/ml，应用流式细胞仪检测细胞凋亡。

六、统计学分析

结 果

一、细胞Smo、Gli1 mRNA表达

PANC1干细胞、PANC1贴壁细胞和H6C7细胞Smo mRNA的表达量分别为1、0.83、2.61；Gli1 mRNA表达量分别为57.27、26.35、1。其中PANC1干细胞Smo mRNA表达是PANC1贴壁细胞的154.76倍，H6C7细胞Smo mRNA表达是PANC1贴壁细胞的403.72倍；PANC1干细胞Gli1 mRNA表达是PANC1贴壁细胞的6.94倍，H6C7细胞Gli1 mRNA表达是PANC1贴壁细胞的0.14倍。与PANC1细胞比较，PANC1干细胞的Smo、Gli1 mRNA表达显著增加(P<0.05)。

二、环巴明对细胞增殖的影响

PANC1干细胞、PANC1及H6C7细胞经0.5、1、2、5、10 μmol/L环巴明作用后，细胞基本上呈剂量、时间依赖性地出现生长抑制。10 μmol/L环巴明作用72 h后，PANC1干细胞和H6C7细胞的生长抑制率分别为(37.85±13.69)%和(43.55±28.98)%，两组间差异显著(P<0.05)，且均显著高于PANC1细胞(8.53±4.43)%的生长抑制率 (P<0.01)。

三、环巴明对细胞周期的影响

10 μmol/L环巴明作用72 h后，PANC1干细胞G1期比例从(67.41±6.35)%显著降至(36.53±6.03)% (P<0.05)； PANC1细胞从(67.64±6.88)%显著降至(53.13±1.10)% (P<0.05)；H6C7细胞从(62.85±4.83)%到(68.22±10.16)%，无明显变化(图1)。

a、c、e为环巴明处理前的细胞周期；b、d、f为10 μmol/L环巴明处理72 h后的细胞周期

图1环巴明处理前后三种细胞的细胞周期

四、环巴明对细胞凋亡的影响

10 μmol/L环巴明处理72 h后，PANC1干细胞凋亡率从(10.95±5.68)%降至(5.73±1.42)%，PANC1细胞从(12.08±4.12)%降至(5.66±1.33)%，H6C7细胞从(2.14±1.47)%降到(1.72±1.08)%，但差异均无统计学意义(P>0.05)。

讨 论

自我更新是肿瘤干细胞的重要生物学特性之一，与肿瘤发生、发展密切相关。Liu等[5]研究表明Hedgehog信号通路可能参与肿瘤干细胞自我更新机制，该通路的异常表达或激活可能是肿瘤发生、发展、复发、转移的关键。环巴明是Hedgehog信号通路中Smo蛋白的特异抑制剂，可通过环巴明 阻断Hedgehog信号通路。Sonic Hedgehog存在于70%的胰腺癌中，与胰腺癌关系密切[6]，但在胰腺癌干细胞中的研究国内外甚少。我们前期研究[4]成功采用悬浮法培养PANC1干细胞，并通过体内外实验证实其具有肿瘤干细胞样特性，在此基础上采用实时 RT-PCR法检测PANC1干细胞Smo和Gli1 mRNA表达，证实了PANC1干细胞存在Sonic Hedgehog信号通路。

增殖能力是肿瘤干细胞自我更新能力的表现之一。本实验中，PANC1干细胞经10 μmol/L环巴明处理72 h后，增殖能力明显下降，这与Peacock等[7]用环巴明处理胶质瘤干细胞和骨髓瘤干细胞的结果相符。肿瘤干细胞是一种慢周期细胞[8]，细胞中以G0/G1期为主。本实验结果显示，环巴明处理前，PANC1干细胞以G0/G1期为主，经10 μmol/L 环巴明处理72 h后，PANC1干细胞G0/G1期比例明显下降，自我更新能力明显抑制，但细胞凋亡率差异无统计学意义，提示环巴明阻断Hedgehog信号通路抑制胰腺癌干细胞的自我更新并非通过影响细胞凋亡实现，其具体机制有待进一步探讨。

[1] Bar EE,Chaudhry A,Lin A,et al.Cyclopamine-mediated Hedgehog pathway inhibition depletes stem-like cancer cells in glioblastoma.Stem Cells,2007,25:2524-2533.

[2] Zhao C,Chen A,Jamieson CH,et al.Hedgehog signaling is essential for maintenance of cancer stem cells in myeloid leukaemia. Nature, 2009, 458:776-779.

[3] 黄凤婷，张世能，黄奕俊，等.人胰腺癌细胞系SW1990中肿瘤干细胞样侧群细胞的分离及生物学特性研究.中华胰腺病杂志,2008,8:372-375.

[4] 张世能,峗淑莉,黄凤婷,等.胰腺癌肿瘤干细胞的悬浮培养法.中华胰腺病杂志,2009,9:315-317.

[5] Liu S,Dontu G,Mantle ID,et al.Hedgehog signaling and bmi-1 regulate self-renewal of normal and malignant human mammary stem cells.Cancer Res,2006,66:6063-6071.

[6] Feldmann G,Dhara S,Fendrich V,et al.Blockade of hedgehog signaling inhibits pancreatic cancer invasion and metastases:a new paradigm for combination therapy in solid cancers.Cancer Res,2007,67:2187-2196.

[7] Peacock CD,Wang Q,Gesell GS,et al.Hedgehog signaling maintains a tumor stem cell compartment in multiple myeloma.Proc Natl Acad Sci USA,2007,104:4048-4053.

[8] Guan Y,Gerhard B,Hogge DE.Detection,isolation,and stimulation of quiescent primitive leukemic progenitor cells from patients with acute myeloid leukemia (AML).Blood,2003,101:3142-3149.

2010-04-07)

(本文编辑：吕芳萍)

Effectsonselfrenewalofpancreaticcancerstemcellsbyinhibitinghedgehogsignalpathway

HUANGFeng-ting,ZHANGShi-neng,LIANGAi-xin,WEIShu-li,ZHUANGXiao-hong,CHENWen-bo.

DepartmentofGastroenterology,SecondAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510120,China

ZHANGShi-neng,Email:shinengz2010@163.com

ObjectiveTo investigate the effects on self-renewal of pancreatic cancer stem cells by inhibiting hedgehog signaling pathway through cyclopamine.MethodsPANC1 stem cells, PANC1 adherent cells and immortalized pancreatic ductal epithelial H6C7 cells were treated with 0.5, 1, 2, 5, 10 mol/L of cyclopamine for 24, 48, 72 h. The expression of Smo mRNA and Gli1 mRNA were detected by real-time PCR. Cell growth viability was measured by CCK 8. Cell cycle and apoptosis were determined by flow cytometry.ResultsSeventy-two hours after cyclopamine treatment, the Smo mRNA expressions of PANC1 stem cells, PANC1 adherent cells and H6C7 cells were 1,0.83 and 2.61; the expressions of Gli mRNA were 57.27,26.35,1; the inhibitory rates were (37.85±13.69)%, (8.53±4.43)%, (43.55±28.98)%. Compared with PANC1, the expressions of Smo mRNA, Gli1 mRNA and the inhibitory rate of PANC1 stem cells significantly increased (P<0.05). The proportion of G1stage of PANC1 stem cells significantly decreased from (67.41±6.35)% to (36.53±6.03)% (P<0.05), and the apoptosis decreased from (10.95±5.68)% to (5.73±1.42)% (P>0.05). The proportion of G1stage of PANC1 cells significantly decreased from (67.64 ± 6.88)% to (53.13±1.10)%(P<0.05); the apoptosis decreased

from (12.08±4.12)% to (5.66±1.33)%(P>0.05). While both the proportion of G1stage and apoptosis of H6C7 cells was not significantly different.ConclusionsCyclopamine can inhibit the proliferation of PANC1 stem cells via blocking hedgehog signal pathway, and the mechanism may not be associated with cell apoptosis.

Pancreatic neoplasm； Stem cells； Hedgehog signal pathway； Self-renewal

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.02.005

广东省自然科学基金(8151008901000139)；广东省医学科研基金(B2009066)

510120 广州，中山大学附属第二医院消化内科

黄凤婷，Email：rachelh1982@163.com

张世能，Email：shinengz2010@163.com