H3N2猪流感病毒诱导的小鼠急性肺损伤与SOD、NO、MDA和OH·变化的相关性*

徐明举， 利 凯， 崔红玉， 魏 东， 张瑞华， 王存连， 李寸欣， 徐 彤

(河北北方学院动物科技学院,河北 宣化 075131)

H3N2猪流感病毒诱导的小鼠急性肺损伤与SOD、NO、MDA和OH·变化的相关性*

徐明举， 利 凯， 崔红玉， 魏 东， 张瑞华， 王存连， 李寸欣， 徐 彤△

(河北北方学院动物科技学院,河北 宣化 075131)

目的探讨超氧化物歧化酶(SOD)活性以及一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)和羟自由基(OH·)含量的变化与H3N2猪流感病毒诱导的小鼠肺损伤的关系。方法选用6-8周龄、SPF级BALB/c小鼠80只,随机分为H3N2病毒感染急性肺损伤组和模拟感染对照组，每组各40只。在感染后的第3、5、7、10和14 d,每组处死小鼠6只，做如下处理：其中2只小鼠取肺组织进行HE染色，观察肺组织的病理学变化；剩余4只小鼠处死，收集血液分离血清；然后进行支气管肺泡灌洗，收集支气管肺泡灌洗液(BALF)。测BALF 和血清内SOD活性以及NO、MDA和OH·含量。结果病毒感染小鼠肺脏组织学变化表现为以严重的肺泡间质水肿、炎性细胞渗出、出血为特征的弥漫性肺泡损伤；与模拟感染对照组相比，感染组BALF与血清内的NO、MDA和OH·的含量均明显增加，差异显著；感染组SOD活性与对照组相比显著下降。BALF内SOD、NO、MDA和OH·的变化幅度明显大于血清的变化。结论感染小鼠血清和BALF内NO、MDA和OH·显著升高，表明在H3N2猪流感病毒诱导的小鼠肺损伤过程中上述自由基可能发挥重要作用。

H3N2猪流感病毒； 急性肺损伤； 超氧化物歧化酶； 一氧化氮； 丙二醛； 羟自由基

急性肺损伤(acute lung injury，ALI)是一种以弥漫性肺细胞损伤为基础，肺水肿和微肺不张为病理特征，并可迅速影响气体交换功能为临床特点的肺部炎症和通透性增加综合征，多见于机体遭受严重感染、创伤、休克、毒物中毒(包括吸入有毒气体)等[1-3]。猪流感病毒具有重要的公共卫生学意义，尤其2009年新型甲型H1N1的流行提示猪流感病毒有可能成为造成人类流感流行的潜在因素，目前已经证实人-禽-猪重组的H3N2猪流感病毒的存在。目前已知流感病毒是引起急性肺损伤的重要感染性因素之一。关于流感病毒引起急性肺损伤的机制，目前研究认为炎性细胞因子大量释放，最终导致弥漫性肺泡损伤为特征的急性肺损伤，最终引起非心源性肺水肿和低氧血症，导致呼吸衰竭死亡[4]。但是Salomon 等[5]在研究禽流感H5N1病毒导致小鼠肺损伤机制时，使用肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)基因缺失小鼠和抑制炎症因子的糖皮质激素皮质酮进行治疗发现对于死亡率和肺损伤没有明显的影响。其它一些研究证实在流感病毒感染引起的ALI/ARDS过程除了TNF-α和白细胞介素 6 (interleukin-6，IL-6)发挥作用外，可能存在其它更重要的致病机制[6,7]。

自由基学说(free radical theory)是20世纪50年代的著名学者Harman首先提出并得到其他学者的认可。Imai等[8]研究认为活性氧类自由基在激活Toll样受体-4信号通路进而诱导炎症细胞因子产生中发挥重要的作用。在研究H3N2猪流感病毒感染小鼠诱导肺损伤过程中我们发现，TNF-α和IL-6为主的炎症细胞因子明显增加，表明炎症细胞及细胞因子与H3N2猪流感病毒引起小鼠肺损伤具有一定的相关性，而自由基如超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、一氧化氮(nitric oxide, NO)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)和羟基自由基(hydroxyl radical，OH·)是否与H3N2猪流感病毒感染引起小鼠肺损伤具有相关性目前尚未见到文献报道。因此，本研究探讨SOD、NO、MDA、OH·与H3N2猪流感病毒诱导小鼠急性肺损伤关系，为进一步阐明H3N2猪流感病毒引起哺乳动物肺损伤的机制奠定基础。

材 料 和 方 法

1材料

1.1H3N2猪流感病毒和实验动物 SI A/ swine /Hebei/2/2008(H3N2)病毒(本实验室分离、鉴定)，将该病毒经10日龄的SPF鸡胚(北京实验动物中心提供)盲传3代，收集死亡的鸡胚感染性尿囊液，分装后于-70℃冰箱保存，待用；80只6-8周龄的SPF级小鼠，购买于北京梅里亚通实验动物中心。

1.2主要试剂 SOD、NO、MDA、OH·检测试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。

2方法

2.1H3N2-SIV感染小鼠急性肺损伤模型的建立 80只6-8周龄SPF级BALB/c系雌性小鼠随机分成2组，每组40只。实验组用灭菌生理盐水5倍稀释的含有猪流感H3N2亚型病毒的鸡胚尿囊液经鼻腔途经接种小鼠,接种剂量为每只0.1 mL。正常组小鼠采取相同途经接种0.1 mL的正常鸡胚尿囊液作为对照组。接种后的小鼠隔离饲养于无菌室内，采取自由饮水和采食。同时观察小鼠的临床症状和统计死亡率。

2.2小鼠肺组织病理变化的动态观察 在H3N2-SIV感染小鼠发病过程中，于接种后的3、5、7、10、14 d，每组各处死2只小鼠，取左肺的一部分于10%甲醛液固定，经石蜡包埋，做成4 μm的切片，HE染色，观察病理组织学变化。

2.3血清中SOD活性及NO、MDA和OH·含量的测定 在接种后的3、5、7、10、14 d，每组各处死4只小鼠，收集血液，分离血清，测定NO、MDA、SOD和OH·含量。NO含量用硝酸还原酶法测定；MDA含量用改良的硫代巴比妥酸法测定；OH·含量采用Fenton反应进行测定；SOD活性采用亚硝酸盐法测定，以上操作均严格按照相应试剂盒使用说明进行。

2.4小鼠支气管肺泡灌洗液(bronchial alveolar lavaged fluid，BALF)内SOD活性及NO、MDA和OH· 含量的测定 在感染后的3、5、7、10、14 d，取实验组和对照小鼠采用断颈方法处死。参照Majeski等[9]描述的方法收集BALF:处死小鼠后立即剥离气管,气管插管后分2次注入4 ℃的灭菌生理盐水，进行支气管肺泡灌洗,每次注入0.5 mL。反复灌洗3-4次,抽吸后注于1.5 mL EP 管中,每只小鼠的BALF的回收率应大于80%。将BALF用白细胞稀释液作1∶5倍稀释，然后以1 500 r/ min 离心10 min ,除去细胞沉渣, 将上清液于-70 ℃冻存，待用。按照相应试剂盒使用说明测量BALF内SOD活性及NO、MDA和OH·含量。

3统计学处理

结 果

1临床症状和病理变化

感染小鼠病理组织学变化以肺部最为严重，感染后的第3 d主要表现为支气管和细支气管周围小血管间质明显水肿、疏松，有少量淋巴细胞炎性渗出，尤以肺边缘最为明显，支气管部分黏膜上皮坏死，腔内有嗜中性细胞为主的炎症细胞和脱落的上皮，见图1B。在感染后的第7 d肺泡壁水肿、增厚，肺泡腔变小，肺泡腔内有大量的粉红色的炎症蛋白和水肿液；个别样本出现肺泡间增宽的间质性肺炎症状；血管和细支气管周围的间质明显疏松水肿，内有大量的炎症细胞和红细胞，形成细支气管性肺炎。肺组织出血明显，在肺泡腔和间质内有大量的红细胞，见图1C。对照组小鼠肺组织未见异常变化，见图1A。

2血清SOD活性及NO、MDA和OH·含量的变化

感染的实验组与模拟感染对照组小鼠相比，血清中NO、MDA和OH·的含量从感染后的第3 d开始逐渐升高，出现显著差异(Plt;0.05);从感染后的第6-7 d，血清中NO、MDA和OH·的含量极显著升高，和对照组相比出现极显著差异(Plt;0.01)；从感染后的第10 d开始，NO、MDA和OH·的含量开始下降，但与对照组相比仍呈显著差异(Plt;0.05)；SOD活性的变化与NO、MDA和OH·的变化趋势相反，即感染的实验组小鼠血清中SOD活性的变化表现下降的趋势。在感染后第3 d开始至感染后的第10 d，SOD活性出现显著降低，与对照组相比差异显著(Plt;0.01)；感染后的第14 d，实验组小鼠血清中SOD活性开始回升，但仍低于对照组，见图2。

Figure 1. The histopathological changes of the lung in H3N2 virus-infected mice.A:control group; B, C:infected group 3 days and 7 days after inoculation,respectively.

Figure 2. The activity of SOD and the content of NO,MDA and OH· in serum of mice. ±s.n=4.*Plt;0.05, **Plt;0.01 vs control group.

3支气管肺泡灌洗液中SOD活性及NO、MDA和羟自由基含量的变化

在支气管肺泡灌洗液内SOD活性及NO、MDA和OH·含量的变化趋势与血清中的变化完全一致，只是变化的幅度更大，出现变化的时间更早。在感染后的第3 d，实验组内小鼠的NO、MDA和OH·即显著升高(Plt;0.01)，这种变化一直持续到感染后的第10 d；SOD活性的变化也是从感染后第3 d开始出现显著的降低(Plt;0.01)；在感染后的第14 d，SOD活性仍明显低于对照组(Plt;0.05)，见图3。

讨 论

急性肺损伤时,中性粒细胞在炎症介质和趋化因子作用下,经黏附、移出血管、趋化游走至炎症灶,通过吞噬、脱颗粒和呼吸爆发等反应释放溶酶体酶及氧自由基等一系列代谢产物,在清除致炎物的同时也损伤肺组织,因此活性氧和氧自由基与肺损伤有密切关系。随着病情的进展,氧自由基可进一步使脂质过氧化,其终产物MDA水平上升,进一步引起蛋白质交联变性、DNA断裂,破坏肺组织结构[10]。本课题先前的研究表明，在H3N2猪流感病毒诱导小鼠急性肺损伤过程中肺组织及支气管肺泡灌洗液中嗜中性白细胞显著增加，因此为进一步诱导以氧自由基为主的自由基的产生创造条件。

本研究发现血清和支气管肺泡灌洗液内NO、MDA和OH·含量在感染后第3 d开始均显著增加，至感染后的5-7 d极显著增加；而且这些自由基含量的变化程度与肺部病理损伤的严重程度呈正相关；血清和支气管肺泡灌洗液内SOD的变化与MDA的变化趋势相反，表明在H3N2猪流感病毒感染过程中由于以OH·为主的氧自由基的大量产生，不断消耗SOD，结果使SOD的含量不断下降，不能及时清除这些自由基，进而导致肺泡组织细胞脂质过氧化，引发肺泡组织的广泛性损伤。这些结果表明NO、MDA和OH·等参与H3N2病毒感染诱导小鼠肺损伤过程。李华强等[11]利用绿脓杆菌肺炎大鼠模型发现，在绿脓杆菌引起的急性肺损伤过程中NO、MAD以及OH·显著增高, 这提示在急性肺炎时NO、MAD以及OH·水平升高, 提示这些自由基成为造成肺组织损伤的一种重要因素之一。

Figure 3. The activity of SOD and the content of NO,MDA and OH· of BALF in mice±s.n=4. *Plt;0.05, **Plt;0.01 vs control group.

本研究发现支气管肺泡灌洗液内NO、MDA和OH·的含量的变化早于血清，而且变化的幅度也高于血清，这些结果提示H3N2病毒感染小鼠过程中肺部感染是病毒损伤的主要器官，因此预防和控制H3N2猪流感病毒感染导致的肺损伤是将来治疗H3N2病毒感染的主要途径之一。

关于病毒感染诱导急性肺损伤的机制，目前研究认为炎症细胞因子尤其是TNF-α和IL-6等大量释放，引发炎症因子风暴，导致肺泡上皮细胞和毛细血管内皮细胞的损伤，最终引起肺心源性肺水肿和低氧血症，引起呼吸衰竭死亡[4]。但是最近的研究利用TNF-α基因缺失小鼠、抗TNF-α的单克隆抗体以及抑制炎症反应的糖皮质激素均不能降低H5N1禽流感病毒引起小鼠的死亡率，这些研究提示在病毒性因素引起的肺损伤中以TNF-α和IL-6为主的炎症因子引起的细胞因子风暴不是首要原因。本研究发现NO、MDA和OH·等在H3N2猪流感病毒的诱导小鼠肺损伤的过程显著升高，提示因自由基引起氧化应激导致的损伤可能是感染动物肺损伤的重要原因，通过阻断产生NO、MDA和OH·的信号通路进而抑制这些自由基的产生，可能成为将来预防和治疗H3N2猪流感病毒感染导致的肺损伤提供借鉴。

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EffectofH3N2swineinfluenzavirus-inducedacutelunginjuryonchangesofOH·,NO,MDAandSODinmice

XU Ming-ju, LI Kai, CUI Hong-yu, WEI Dong, ZHANG Rui-hua, WANG Cun-lian, LI Cun-xin, XU Tong

(DepartmentofAnimalScience,HebeiNorthUniversity,Xuanhua075131,China.E-mail:xutong1969@sohu.com)

AIM: To investigate the relationship between acute lung injury induced by H3N2 swine influenza virus and the changes of superoxide dismutase(SOD), nitric oxide(NO), malondialdehyde(MDA) and hydroxyl radical(OH·) in mice.METHODSEighty BALB/c mice (6 to 8 weeks old) were divided into H3N2-infected group and mock-infected group. The mice in H3N2-infected group were intranasally inoculated with A/swine/Hebei/2/2008 (H3N2) virus in 100 μL infectious allantoic fluid and the same volume of non-infectious allantoic fluid was given to the mock-infected mice. On the 3rd, 5th, 7th, 10th or 14th day after inoculation, 6 mice in each group were killed and the changes of pathological lesions in the lungs of the mice were observed. The other mice were used to collect bronchial alveolar lavage fluid (BALF) and serum for determining the content of NO, MDA and OH· and the activity of SOD.RESULTSIn H3N2-infected mice, alveolar and interstitial edema, hemorrhage, inflammation cell migration and infiltration were observed in the lungs, the levels of NO, MDA and OH· in BALF dramatically increased, and the activity of SOD was dramatically decreased in BALF (Plt;0.01) as compared with those in mock-infected mice (Plt;0.01). Although the changes of SOD, NO, MDA and OH· in serum had the same tendency as those in BALF, the extents of the changes were smaller.CONCLUSIONThe increases in NO, MDA and OH· indicate their important roles in acute lung injury induced by H3N2 swine influenza virus in mice.

H3N2 swine influenzavirus; Acute lung injury;Superoxide dismutase; Nitric oxide; Malondialdehyde; Hydroxyl radical

1000-4718(2011)04-0783-04

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.04.031

2010-09-25

2011-02-16

河北省教育厅自然科学基金资助项目(No.2008104)

△通讯作者 Tel:0313-4029336; E-mail:xutong1969@sohu.com