愈骨疗伤胶囊提取工艺的优化

孙 艳，卞 俊，许志仁，陈海飞，柳正良

(1.解放军第411医院药学科，上海200434；2.江西中医学院药学院，南昌333004)

[本文编辑] 邢文荣 姚春芳

愈骨疗伤胶囊为解放军第411医院临床应用多年的自制制剂，制剂批准文号[南制字(2006)F57023]，含有川续断、骨碎补、白芍、当归、没药等11味药材，以川续断、骨碎补为君药，补肝肾、续筋骨、调和血脉，补肾活血。川续断的主要活性成分为川续断皂苷Ⅵ，现代药理学研究表明，川续断皂苷Ⅵ具有抗骨质疏松、促进骨骼愈合的作用[1]。骨碎补的主要活性成分为柚皮苷，具有补肝肾、强筋骨、降血脂的药理作用[2]。本研究以川续断皂苷Ⅵ和柚皮苷为指标性成分，采用L9(33)正交试验，考察回流提取与超声循环提取的区别。在回流提取中，考察不同溶剂，即水和不同浓度的乙醇对其含量的影响，以川续断皂苷Ⅵ和柚皮苷转换率综合得分为考察指标，对处方提取工艺进行筛选。

1 仪器和试药

1.1 仪器 Waters高效液相色谱仪，包括2487双波长紫外检测器、1525泵、717自动进样器 ；LXJII离心沉淀机(上海医疗器械三厂)；DZF－6020型真空干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；202－00型电热恒温干燥箱(浙江宁波生化仪器厂)；H.H.S 11－2B电热恒温水浴锅(上海医疗器械五厂)；SENCO W201恒温水浴锅及SENCO R系列旋转蒸发器(上海申生科技有限公司)；SK3300H型超声波清洗仪(上海科导超声仪器厂)；AB104－N电子分析天平(梅特勒－托利多仪器公司)；HF－50B超声循环提取机(北京弘祥隆生物技术开发有限公司)。

1.2 试药 骨碎补(批号2008090600)、川续断(批号2009030124)、白芍(批号20081202170)、甘草(批号2009052201)和当归(批号2009030049)等药材均购自于上海市雷允上中药饮片公司，符合《中华人民共和国药典》2010年版标准。川续断皂苷Ⅵ对照品(批号111685－200802)和柚皮苷对照品(批号为110722－200610)均由中国药品生物制品检定所提供。水为重蒸馏水(本院自制)，乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

2 方法和结果

2.1 川续断药材的含量测定 取川续断粗粉约0.5g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入25ml甲醇，密塞，称定重量，超声处理30min，放冷，再次称定，用甲醇补足其失重。摇匀，滤过，取滤液5ml，置于50ml容量瓶中，用流动相定容至刻度线。摇匀，即得。按《中华人民共和国药典》2010年版一部[3]方法测得其含量为7.09%。

2.2 骨碎补药材的含量测定[3]取骨碎补粗粉约0.25g，精密称定，加甲醇30ml，加热回流3h，放冷，滤过，滤液置50ml量瓶中，用少量甲醇分数次洗涤容器，洗液滤入同一量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得供试品溶液。按文献[3]方法测得骨碎补中柚皮苷的含量为0.53%。

2.3 提取物中川续断皂苷Ⅵ和柚皮苷的含量测定

2.3.1 色谱条件 迪马 C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；采用梯度洗脱法，A为蒸馏水，B为乙腈，梯度洗脱：1→20→30min，A：80%→60%→80%；流速为1.0ml／min；采用双波长检测，212nm测定川续断皂苷Ⅵ，283nm测定柑皮苷；柱温为30℃。

图1 川续断皂苷Ⅵ和柚皮苷的HPLC谱图Figure 1 HPLC photograms of asperosaponinⅥand naringin

2.3.2 对照品溶液的制备 称取川续断皂苷Ⅵ对照品适量，置50ml容量瓶中，加甲醇溶解，制成0.2mg／ml溶液作为川续断皂苷Ⅵ储备液(1)。称取柚皮苷对照品适量，置50ml容量瓶中，加甲醇溶解制成0.15mg／ml溶液，作为柚皮苷储备液(2)。精密吸取储备液(1)和储备液(2)各1.0ml，置10ml容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，过0.45μm的滤膜后作为混合对照品溶液。

2.3.3 供试品溶液的制备与测定 分别取川续断和骨碎补药材样品的提取物粉末约0.05g，精密称定，置于25ml容量瓶，加乙腈:水(30:70)溶液超声(功率30W，频率50Hz)溶解，放冷，稀释至刻度，摇匀，过0.45μm的微孔滤膜得到供试品溶液，备用。分别精密吸取混合对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入HPLC仪测定，在212nm处测定川续断皂苷Ⅵ峰面积，在283nm处测定柚皮苷对照品溶液峰面积，见图1。

2.3.4 线性关系考察 精密称定川续断皂苷Ⅵ对照品8.1mg，置于50ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为储备液。精密称定柚皮苷对照品5.1mg，置于50ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为储备液。分别精密吸取以上两种储备液 5、2.5、1.25、0.625、0.063ml，置于10ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品溶液，分别吸取20μl注入HPLC仪，记录色谱峰。以峰面积(A)为纵坐标，进样浓度(c)为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程：A川续断皂苷Ⅵ＝228 217c川续断皂苷Ⅵ－4 176，r＝0.999 8，n＝6，线性范围 为0.041～6.48μg／ml；A柚皮苷＝5 999 871c柚皮苷＋3 556，r＝0.999 9，n＝6，线性范围为2.76～16.56μg／ml。

2.3.5 精密度实验 取同一混合对照品溶液，重复进样6次，在212nm处测定川续断皂苷Ⅵ峰面积，得其RSD为0.65%(n＝6)；在283nm处测定柚皮苷峰面积，得其RSD为0.57%(n＝6)。

2.3.6 稳定性实验 取同一供试品，分别于配制后0、2、4、6、8、10、16h测定其峰面积，求得川续断皂苷Ⅵ的RSD＝1.92%(n＝7)；柚皮苷RSD＝1.59%(n＝7)。结果表明供试品溶液在16h内基本稳定。

2.3.7 重复性实验 取同一供试品6份，按2.3.3项方法和2.3.1项色谱条件分别测定含量，求得川续断皂苷Ⅵ的 RSD＝1.46%(n＝6)，柚皮苷RSD＝1.1%(n＝6)，表明重复性良好。

2.3.8 加样回收率实验 称取已知含量醇提正交试验1号样品，共6份。精密称定，分别加对照品溶液，按上述实验方法分别测定含量，计算加样回收率，川续断皂苷Ⅵ平均回收率为101.04%，RSD为0.57%(n＝6)，柚皮苷平均回收率为102.87%，RSD为1.43(n＝6)。

2.4 工艺优化 对愈骨疗伤胶囊处方中药材采用水提、醇提、超声循环这3种方法进行提取，比较指标性成分的转换率大小，优选其最佳提取工艺。按2.1和2.2项方法测得川续断皂苷Ⅵ和柚皮苷的含量，从而得到两者的转换率，并按加权系数法进行评分。川续断皂苷Ⅵ的转换率(X)＝(正交试验各供试品中川续断皂苷Ⅵ的量／川续断皂苷药材中川续断皂苷Ⅵ的量)×100%；柚皮苷的转换率(Y)＝(正交试验各供试品中柚皮苷的量／骨碎补药材中柚皮苷的量)×100%，综合评分(Z)＝0.5X＋0.5Y。

2.4.1 实验因素与水平 水提、醇提和超声循环按表1因素水平进行提取。

2.4.2 L9(33)正交试验 根据处方比例称取各药材，即称取川续断粉末和骨碎补粉末各6g及其他各味药材共46.5g，按照正交试验设计，各因素水平进行加热回流提取与超声循环提取，得到的液体在2×103×g条件下离心20min，抽滤，减压浓缩干燥至恒重，分别得到9个样品。

表1 提取工艺因素水平表Table 1 Factors and levels of extraction process

2.4.3 正交试验结果分析 测定各样品中川续断皂苷Ⅵ与柚皮苷含量，按2.3.3项下方法进行含量测定并计算其综合评分，其结果见表2。R值越大，表明该因素的影响越大，水为溶剂时三因素的影响强度为B水提＞C水提＞A水提，其最佳提取工艺为A3B1C2，即加8倍量的水，回流提取2次，每次1h。以醇为溶剂时，三因素的影响强度为C醇提＞A醇提＞B醇提，其最佳提取工艺为A3B2C3，即加8倍量55%的乙醇，回流提取3次，每次1.5h。超声循环提取时，三因素影响强度为 A超声＞B超声＞C超声，其最佳提取工艺为A1B3C2，即加75%的乙醇，以1 400W的功率提取90(30，30，30)min。

2.5 验证实验 为了进一步考察工艺条件的可靠性和稳定性，按处方量取药材共93g，按正交试验优选得到的最佳提取工艺条件重复进行3次实验，在对实验结果不产生显著性差异的前提下，从经济成本与节能的角度考虑，将醇提工艺进行改动，即将8倍量55%的乙醇提取3次改为提取2次后，醇提得到川续断皂苷Ⅵ的转换率为107.86%，柚皮苷转换率为103.90%，综合评分为105.88。经最佳提取工艺得到的粉末中川续断皂苷Ⅵ的转换率与柚皮苷转换率均高于试验各组别，而醇提的综合评分最高，为愈骨疗伤胶囊的工艺确定提供科学依据。

表2 正交试验设计及结果Table 2 Design and results of orthogonal test

3 讨 论

在综合评分时对于加权系数的选择上，因制剂中川续断皂苷Ⅵ与柚皮苷均为其指标性成分，故两种成分具有相同作用，应具有相同的权重系数，故综合评分(Z)＝0.5X＋0.5Y。研究中对川续断皂苷Ⅵ与柚皮苷采用同一流动相系统、不同波长进行一次进样，同时得出两种指标性成分的含量。实验初期，采用不同比例乙腈－水进行等度洗脱时不能使川续断皂苷Ⅵ与柚皮苷两者同时达到很好的分离效果，改用乙腈－水进行梯度洗脱，调整两者比例，使两物质达到很好的分离效果。对于波长的选择上，在212nm处川续断皂苷Ⅵ有最大吸收，柚皮苷有吸收，但212nm不是柚皮苷的最大吸收波长，其最大吸收波长为283nm。本研究依据《中华人民共和国药典》2010版一部对川断续和骨碎补的检测波长进行检测。本研究仅从指标性成分的含量角度进行工艺的筛选，课题在接下来将从药效学的角度对工艺进行进一步确认。

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[3]国家药典委员会.中华人民共和国药典.2010年版 一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：239－240，309－310.State Pharmacopoeia Committee.Pharmacopoeia of the People’s Republic of China.2010ed.Volume 1[S].Beijing：Chinese Medical and Technology Press，2010：239－240，309－310.Chinese.