喘可治注射液对大鼠抗炎和免疫调节机制的研究

2011-11-20蔡宇波曹兰芳李祎群

药学服务与研究 2011年5期

费辛，蔡宇波，曹兰芳，李祎群

(1.上海交通大学医学院附属仁济医院儿科，上海200127；2.上海交通大学医学院附属仁济医院中医科，上海200127)

[本文编辑] 阳凌燕

支气管哮喘(以下简称哮喘)是最常见的以气道高反应性为特征的慢性呼吸道疾病，为世界医学界公认的四大顽症之一。近年来，由于环境的不断变化，哮喘发病率呈上升趋势。据统计，全球约有3亿哮喘病人，我国哮喘病人约达2 000万[1]。传统中医理论认为，哮喘多归属于“哮病”，众多医学家认为宿痰伏于肺是发病关键。喘可治注射液是国家二类新药，主要由巴戟天和淫羊藿提取物组成。巴戟天含有单糖、多糖、树脂、维生素C、必需氨基酸、金属元素等，淫羊藿含有淫羊藿多糖、淫羊藿苷、淫羊藿黄酮等多种有效成分，二者均具有温阳补肾、助阳益精和祛风除湿等功效。近年来，临床许多研究发现，喘可治注射液除具有止咳、平喘的功效外，还具有抗过敏、抗炎、增强应激能力、调节免疫功能等疗效，但其作用机制尚不清楚。本研究探索喘可治注射液对大鼠抗炎和调节免疫功能的可能机制，以期发现该注射液有效治疗哮喘的部分作用原理。

1 材料和试剂

1.1 实验动物雄性Wistar大鼠[上海西普尔－必凯实验动物有限公司，许可证号：SCXK(沪)2008－0016]60只，体重为(250±20)g。

1.2 试药喘可治注射液(2ml／支，由巴戟天、淫羊藿等中药提取物组成，珠海健心医药有限公司，批号20100102)；地塞米松注射液(5mg／支，上海信谊制药厂，批号1004032)。卵蛋白(美国Sigma公司)；大鼠外周血IL－4和INF－γ试剂盒(上海依科赛生物制品有限公司)；抗大鼠CD3－PE单抗、抗大鼠CD4－APC单抗和抗大鼠 CD25－PerCP 单抗 (美国eBioscience公司)；抗大鼠 CD161a－Fitc单抗(美国BD公司)。

1.3 仪器 Par Imaster雾化吸入器(德国百瑞有限公司)，流式细胞仪(美国BD公司)。

2 方法

2.1 实验分组 60只雄性Wistar大鼠随机分为6组，每组10只。A组为正常对照组；B组为模型组，致敏造模；C、D、E组为喘可治注射液高、中、低剂量组，致敏造模后分别腹腔注射10、5、2.5ml·kg－1·d－1喘可治注射液治疗；F组为地塞米松阳性对照组，致敏造模后肌内注射地塞米松0.5ml·kg－1·d－1。

2.2 致敏和造模采用卵蛋白攻击法致敏大鼠，致敏液为10%氢氧化铝凝胶和5%卵蛋白的混合液，激发液为2%卵蛋白液。实验第1天和第8天，B至F组每只大鼠腹腔内注射致敏液0.5ml。再于大鼠皮下分为5点，每点各注射致敏液0.1ml，合计每只大鼠注射致敏液1.0ml。A组采用同样的方式和剂量注射生理盐水。实验第15天开始，将B至F各组大鼠置于自制的密闭箱内，采用Par Imaster雾化吸入器吸入新鲜配置的2%卵蛋白液，1次／d，每次20min，连续吸入14d。A组采用同样的方式和剂量给予生理盐水雾化吸入。

2.3 药物治疗喘可治注射液组于实验开始的第22天起，雾化吸入致敏液后按照2.1项下剂量分别腹腔注射喘可治注射液，1次／d，连续给药7d。地塞米松组在实验的第26天起，雾化吸入致敏液后马上肌内注射地塞米松注射液0.5ml·kg－1·d－1，连续3d。

2.4 取材和处理于实验的第29天处死各组大鼠，取血样和肺叶。肺叶用HE染色并行病理切片，观察炎症情况。用ELISA法测定大鼠外周血中IL－4和IFN－γ浓度，采用流式细胞仪测定大鼠外周血中CD4＋CD25＋T调节细胞和CD3－CD161a＋NK细胞占淋巴细胞的百分比。

2.5 统计分析采用SAS6.02软件进行分析，全部数据均用±s表示，多组间比较采用单因素方差分析(One Way ANOVA)，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 一般情况观察正常对照组大鼠表现为呼吸平稳，反应灵敏，毛色光洁，饮食、排便无异常。其余各组大鼠经卵蛋白激发后，在雾化激发过程中均可出现烦躁不安、呼吸增快、腹肌收缩、行动迟滞或俯伏不动、反应迟钝等症状。当进入用药治疗阶段后，喘可治注射液各剂量组和地塞米松组大鼠的上述症状均得到不同程度的改善。

3.2 肺部炎症反应如图1所示，3个剂量的喘可治注射液组的大鼠虽然与正常对照组大鼠相比，尚存在炎症的各种表现，但与模型组大鼠比较，在病理方面均表现为炎症反应减轻，炎性细胞侵润少，血管平滑肌增生程度亦轻。而与阳性对照地塞米松组相比，喘可治注射液组大鼠总体炎症反应情况接近。

3.3 IL－4和INF－γ浓度测定从表1结果可见，与模型组相比，高、中、低剂量喘可治注射液组和地塞米松组的IL－4浓度均明显下降(P＜0.01)，各喘可治注射液组间及与地塞米松组比较，IL－4浓度差异无统计学意义。其中高剂量喘可治注射液组的IL－4浓度绝对值相对其他组降低更多。喘可治注射液组IFN－γ的浓度均较模型组有所上升，但仅高剂量组有显著差异(P＜0.01)。各剂量喘可治注射液组IFN－γ浓度与地塞米松组比较均无显著差异。

图1 各组大鼠肺部组织病理切片(HE染色，×100)Figure 1 Pathological sections of lung tissues of each group in rats(HE staining，×100)

表1 大鼠外周血中IL－4和INF－γ浓度比较Tabel 1 Comparison of concentrations of IL－4and IFN－γof peripheral blood in rats(n＝10，±s，ρB／pg·ml－1)

＊＊P＜0.01，与模型组比较

组别 IL－4 IFN－γ正常组 7.87±3.85＊＊40.85±16.04模型组 50.94±20.11 24.57±7.59喘可治注射液高剂量组 10.65±4.13＊＊ 62.34±26.36＊＊喘可治注射液中剂量组 17.50±6.97＊＊ 34.32±9.53喘可治注射液低剂量组 20.68±6.35＊＊ 28.16±13.03地塞米松组 17.17±8.26＊＊26.60±11.67

3.4 CD4＋CD25＋T调节细胞和CD3－CD161a＋NK细胞占淋巴细胞的百分比高、中、低剂量喘可治注射液组大鼠外周血CD4＋CD25＋T调节细胞占淋巴细胞的百分比明显上调，与模型组比较具有显著性差异(P＜0.05)。各治疗组与地塞米松组比较，CD4＋CD25＋T调节细胞百分比无显著性差异(P＞0.05)。CD3－CD161a＋NK 细胞的百分比模型组最低，地塞米松组最高，高、中、低剂量喘可治注射液组百分比也有升高，但与模型组相比，差异无统计学意义。各组间比较无显著差异(P＞0.05，见表2)。

4 讨论

支气管哮喘目前多采用包括糖皮质激素在内的抗炎药物治疗，但长期应用糖皮质激素的副作用使其在应用上受到限制。喘可治注射液主要由巴戟天、淫羊藿等中药材经现代科学手段提取精制而成，以淫羊藿为君药，辅以巴戟天。淫羊藿和巴戟天均始载于《神农本草经》，具有补肾助阳、祛风除湿的功效。从中医理论角度说，喘可治注射液的治疗机制是温阳补肾、平喘止咳、标本同治、虚实兼顾。中医的“肾”与“阳”与现代医学的免疫功能密切相关，有研究者认为温阳补肾药能够通过调节下丘脑－垂体－肾上腺皮质和免疫网络而发挥多环节的调节作用，且研究发现补肾药物是先作用于神经内分泌系统，而后才影响免疫系统。

表2 大鼠外周血中CD4＋CD25＋T调节细胞和CD3－CD161a＋NK细胞占淋巴细胞的百分比Table 2 Percentages of CD4＋CD25＋T cells and CD3－CD161a＋ NK cells to lymphocytes of peripheral blood in rats(n＝10，±s，%)

＊P＜0.05，与模型组比较

细胞正常组组别 CD4＋CD25＋T调节细胞CD3－CD161a＋NK 2.05±0.56 10.77±4.02模型组 2.39±0.68 7.84±2.83喘可治注射液高剂量组 2.67±0.76＊ 8.84±2.10喘可治注射液中剂量组 2.87±0.77＊ 9.78±2.18喘可治注射液低剂量组 3.42±0.91＊ 7.96±2.66地塞米松组2.11±0.98 12.24±5.79

IL－4和IFN－γ分别为IgE的正负调节因子，两者比例的失衡，是哮喘病人体内IgE合成过多的主要原因[2]。有研究提出，通过增加IFN－γ的浓度，降低IL－4水平来调节1型辅助性T细胞(Th1)／Th2之间的平衡是治疗哮喘的一个新途径[3]。

CD4＋CD25＋T调节细胞能有效地调节自身反应性T细胞，参与自身免疫性疾病、变态反应、移植排斥反应、肿瘤等的发生发展，既能抑制Th1细胞，也能抑制Th2细胞，是控制免疫反应的中心环节。有研究结果提示CD4＋CD25＋T调节细胞数量的不足和(或)功能降低，可能在哮喘中起着十分重要的作用。有研究表明，NK细胞也是哮喘发病机制中重要的效应细胞之一。NK细胞在不同细胞因子的微环境下功能不同。在IL－4的作用下，人类和鼠的NK细胞分泌IL－5和IL－13，两者均对嗜酸性粒细胞的产生和成熟有不可替代的作用。而IL－12和IFN－γ会抑制 NK细胞分泌IL－5和IL－13，在IL－12作用下，NK细胞分泌IFN－γ，并消灭树突状细胞，从而使免疫反应向 Th1方向分化[4，5]。因此，NK细胞在过敏性疾病，如哮喘中也许具有调节Th1／Th2型免疫反应的能力。动物实验也发现，去除NK细胞后，哮喘模型小鼠的气道炎症的发作受到抑制，肺中的嗜酸性粒细胞和血清中的IgE含量明显降低[6]。目前认为，在哮喘疾病中，NK细胞功能的异常导致和加重了气道炎症，如能在炎症发生和发展的过程中使NK细胞得到正确的细胞因子刺激，使其分泌IFN－γ，则气道炎症可以减轻。

本研究发现，喘可治注射液作为一种温阳补肾的中药合剂，能够减轻哮喘大鼠肺部组织的炎性反应，起到一定的消炎作用。其通过影响IL－4、IFN－γ、CD4＋CD25＋T调节细胞含量，在一定程度上纠正Th1／Th2失衡，从而改善哮喘模型大鼠的病情，且其在几个方面产生的作用与地塞米松的效果比较接近。在对CD3－CD161a＋NK细胞的影响方面，本研究发现各组间比较差异无统计学意义。考虑在数量没有显著差异性变化的情况下，是否各治疗方案实际是对血NK细胞的活性产生了影响，从而产生缓解哮喘的作用，该推测有待进一步研究。

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