改良CTAB法提取大戟属药用植物叶片总DＮA试验

魏胜华 孟娜

摘要：由于大戟属（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ Ｌｉｎｎ）植物叶片中含大量的多糖、酚类等次生代谢物质，严重影响总ＤＮＡ的提取，因此，以大戟属药用植物叶片为材料，对常用的ＣＴＡＢ（Ｈｅｘａｄｅｃｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）法进行了改良，并通过琼脂凝胶电泳法对所提ＤＮＡ样品进行了检测。结果表明，改良ＣＴＡＢ法提取的植物总ＤＮＡ纯度很高，较适合提取大戟属植物的总ＤＮＡ。

关键词：大戟属；药用植物；ＣＴＡＢ法；总ＤＮＡ提取

中图分类号：Ｑ９４９．７５３．５；Ｑ５０３文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）16－3418-03

Ａ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＣＴＡＢ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｔｏｔａｌ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｈｅｒｂ Ｌｅａｖｅｓ ｏｆ Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ Linn

ＷＥＩ Ｓｈｅｎｇ－ｈｕａ，ＭＥＮＧ Ｎａ

（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ａｎｈｕｉ Ｐｏｌｙｔｅｃｈｎｉｃ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｈｕ ２４１０００，Ａｎｈｕｉ， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｃｅｌｌｓ in Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ Ｌｉｎｎ ｌｅａｖｅｓ ｗｅｒｅ ｒｉｃｈ ｉｎ ａｍｙｌｏｓｅ ａｎｄ ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｅｎｅ． Ｔｈｅｓｅ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ provided some ｓｅｒｉｏｕｓｌｙ ａｄｖｅｒｓｅ ｅｆｆｅｃｔs oｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｆｒｏｍ Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ． Ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｌｅａｖｅｓ ｏｆ Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ ａｓ ｍａｔｅｒｉａｌ， ｔｈｅ ＤＮＡ ｗｅｒｅ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｂｙ ａ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＣＴＡＢ（Ｈｅｘａｄｅｃｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ） ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｍｅａｎs ｏｆ ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＣＴＡＢ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ suitable ｆｏｒ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ of its ＤＮＡ ａｎｄ ｉｔ ｗａｓ ａ ｇｏｏｄｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｏｔａｌ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ Ｌｉｎｎ； ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｈｅｒｂ； hｅｘａｄｅｃｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ（CTAB） ｍｅｔｈｏｄ； ｔｏｔａｌ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ

ＤＮＡ的提取與纯化是进行分子标记试验最关键的一步，获得高质量的ＤＮＡ样品是进行ＰＣＲ扩增的首要步骤［１］。从植物材料中提取基因组ＤＮＡ的质量受到多种因素的影响，在不同植物或同种植物不同时期组织中存在着不同数量的多糖、色素以及种类繁多的次生物质，特别是多糖、酚类在提取过程中可与ＤＮＡ产生沉淀，形成包裹ＤＮＡ的黏稠胶状物，其难以溶解或产生褐变，使得ＤＮＡ提取质量较低，获得的ＤＮＡ溶液常常黏度大乃至呈胶状，这些物质如果清除不净则会影响后续的试验研究［２－４］。大戟属（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ Ｌｉｎｎ）为大戟科（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｃｅａｅｃ）植物中最大的一属，全世界有２ ０００余种［5］，其中不少种具有很高的药用价值，李忠国［６］调查发现，安徽省琅琊山药用植物资源中有２２种大戟科药用植物；李惠等［７］通过研究华东地区大戟属药用植物资源后，整理出了２６种大戟属药用植物，并且药用部位明确，疗效确切，具有较高的药用价值。大戟属药用植物的医药价值使得其研究开发成为了热点，尤其是对大戟属药用植物在分子水平上的探讨方兴未艾。目前在大戟属药用植物进行分子标记试验中，由于本属植物具有白色或黄白色乳汁，含酚类、黄酮类等次生物质较多，若提取方法不当，不仅提取出来的ＤＮＡ容易降解，而且会影响ＰＣＲ扩增反应的稳定性和重复性。因此，如何高效简便地去除多糖、多酚等次生物质，对提取纯化大戟属植物ＤＮＡ至关重要。目前，大戟属药用植物总ＤＮＡ提取方法的研究在国内外尚未见报道，所以在前期研究的基础上［８，９］，结合本属植物特点，以经典提取植物ＤＮＡ的ＣＴＡＢ（十六烷基三乙基溴化铵，Ｈｅｘａｄｅｃｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）法为基础［１０］，并加以改进，筛选出一种比较适合大戟属植物ＤＮＡ提取的方法，为大戟属药用植物进一步开发利用提供技术支持。

１材料与方法

１．１材料

１．１．１供试材料试验所用植物材料为采自安徽省琅琊山的大戟（Ｅ． ｐｅｋｉｎｅｎｓｉｓ Ｒｕｐｒ．）、月腺大戟

（Ｅ． ｅｂｒａｃｔｅｏｌａｔａ Ｈａｙａｔａ）；采自芜湖市的乳浆大戟（Ｅ． ｅｓｕｌａ Ｌ．）、斑地锦（Ｅ． ｓｕｐｉｎａ Ｒａｆｉｎ）、地锦（Ｅ． ｈｕｍｉｆｕｓａ Ｗｉｌｌｄ．）、一品红（Ｅ． ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ Ｗｉｌｌｄ． ｅｔ Ｋｌｏｔｚｓｃｈ．），原植物均经安徽师范大学周守标教授鉴定。用于提取ＤＮＡ的材料为各供试植物的新鲜叶片，采后迅速置于冰盒中，带回实验室后，除去主叶脉，在电子天平上精确称取０．５ ｇ，于－２０ ℃冰箱保存３ ｄ。

１．１．２主要试剂①ＤＮＡ抽提缓冲液，ＮａＣｌ ５００ ｍｍｏｌ／Ｌ，Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ １００ ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ值８．０和ＥＤＴＡ ２０ ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ值８．０。②ＤＮＡ裂解缓冲液，ＮａＣｌ ７００ ｍｍｏｌ／Ｌ， Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ５０ ｍｍｏｌ／Ｌ、 ｐＨ值８．０和

ＥＤＴＡ ２０ ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ值８．０，ＣＴＡＢ ５％（m/V），β－巯基乙醇１％（用前加）［１１］。③ＴＥ缓冲液，Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ １０ ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ值８．０和ＥＤＴＡ １ ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ值８．０。④５０×ＴＡＥ缓冲液，Ｔｒｉｓ ２４２ ｇ，冰乙酸５７．１ ｍＬ，ＥＤＴＡ（０．５ ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ值８．０）１００ ｍＬ。⑤氯仿－异戊醇混合液（体积比为２４∶１，下同）。配制药品用的水均为双蒸馏水。将以上缓冲液分装后，密封、灭菌，置于冰箱４℃保存。

１．１．３主要仪器试验中的主要仪器有凝胶成像仪、微波炉、离心机、超低温冰箱、电泳槽、电泳仪、手掌型离心机、恒温水浴锅、电热恒温鼓风干燥箱、超净工作台等。

１．２方法

１．２．１改良ＣＴＡＢ法提取植物总ＤＮＡ①提取前将裂解缓冲液放至６５ ℃水浴中。②称取０．５ ｇ植物材料，用液氮速冻后，迅速研磨成细粉，分装于１．５ ｍＬ的Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中。③在Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中加入１ ｍＬ ＤＮＡ提取缓冲液，用力摇动使其充分混匀后，于１５ ℃、８ ０００ ｇ离心５ ｍｉｎ。④静止后弃上清，再加入１ ｍＬ ＤＮＡ提取缓冲液，充分混匀，于１５ ℃、

８ ０００ ｇ离心５ ｍｉｎ。⑤静止后弃上清，加入１ ｍＬ ６５ ℃预热的ＤＮＡ提取缓冲液，悬浮沉淀，充分混匀，放入６５ ℃水浴３０ ｍｉｎ。⑥于１５ ℃、１２ ０００ ｇ离心５ ｍｉｎ，取上清，加入等体积的氯仿-异戊醇混合液，轻轻颠倒混匀，静置１０ ｍｉｎ。⑦于１５ ℃、１２ ０００ ｇ离心５ ｍｉｎ，取上清，加入等体积的异丙醇，充分混匀，４ ℃静置３０ ｍｉｎ 。⑧于１５ ℃、１２ ０００ ｇ离心１０ ｍｉｎ，静止后弃上清，加入７５ ％（V/V）乙醇洗数次。⑨于１５ ℃、１２ ０００ ｇ离心３ ｍｉｎ，静止后弃上清，自然风干直至无酒精味。⑩加入１００ μＬ ＴＥ缓冲液，放入４ ℃环境待用，或－２０ ℃储存。

１．２．２电泳检测对所提取的ＤＮＡ取３～５ μＬ于０．８％的琼脂糖凝胶上，以５ V／ｃｍ电泳１ ｈ左右，ＥＢ染色２０～２５ ｍｉｎ，在凝胶成像系统（ＡｌｐｈａＩｍａｇｅｒ）中观察和拍照。

２结果与分析

２．１ＤＮＡ电泳结果

将叶片各部位提取的ＤＮＡ进行琼脂糖凝胶电泳，检测结果见图１。ＤＮＡ电泳结果显示，改良ＣＴＡＢ法所提取的大戟属植物叶片的ＤＮＡ为一条清晰完整的条带，ＤＮＡ片段大小较一致，条带后面没有明显的拖尾，证明所提叶片的总ＤＮＡ含杂质较少。

２．２總ＤＮＡ纯化

加入等体积的氯仿－异戊醇混合液，轻缓颠倒混匀，室温静置１０～１５ ｍｉｎ；于１2 ０００ ｇ离心１０ ｍｉｎ；重复前面步骤。取上清液，加入终浓度０． ２～０． ４ ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＡｃ、1２倍体积的无水乙醇，放置１ ｈ。１２ ０００ ｇ离心１０ ｍｉｎ，弃上清液。用７０ ％乙醇洗涤沉淀２～３次，自然干燥后，溶于５０～１００ μＬ ＴＥ中，－２０ ℃保存备用。

３讨论

虽然植物ＤＮＡ的提取是一项常规的分子生物学实验技术，但由于大戟属植物组织细胞中含有大量的酚类、多糖及其他次生代谢产物，使得用传统的ＣＴＡＢ方法难以分离出高质量的ＤＮＡ，如果提取方法选择不当，会干扰后续的操作。作者对大戟属植物叶片总ＤＮＡ的提取过程经过反复的改进，最后提取出了质量较高的总ＤＮＡ，并在提取中总结出以下操作事项，以期为大戟属药用植物的分子生物学研究提供技术支撑。

１）首先，用于ＤＮＡ提取的植物材料是从远离实验室的野外采集获得，新鲜材料在旅途中容易枯萎、腐烂，特别是一些离体材料极易受到ＤＮＡ酶的作用，导致ＤＮＡ的降解。因此采集后必须迅速置于冰盒中，带回实验室。

２）植物材料在研磨时，一定要使材料处于低温状态，而且所用研钵应该是预先在－２０ ℃冰箱冷冻过夜、待其彻底冷却后再放入植物材料。在研磨过程中，确保不要让液氮挥发干净，以防止植物材料回温，否则会造成ＤＮＡ的严重降解；研磨叶片时，粉末研得越细越好，研磨好的材料非常容易变褐，宜迅速转入Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中，不要使之融化，以免造成ＤＮＡ的降解。

３）在提取ＤＮＡ的过程中，所有的操作均需要动作轻柔，避免剧烈振动，以免ＤＮＡ断裂降解。

４）在用氯仿-异戊醇混合液抽提时，离心温度应保持不低于１５ ℃；若温度太低，可能导致ＣＴＡＢ沉淀，从而损失ＤＮＡ；在离心前增加氯仿－异戊醇混合液和提取缓冲液的接触时间，让杂质更好地被分离，减少用氯仿－异戊醇混合液的抽提次数，避免操作过程中ＤＮＡ的污染。

５）ＣＴＡＢ是一种阳离子去污剂，既能有效裂解植物的细胞壁，又能去除多糖类物质，还可以溶解细胞膜，较好去除多糖的干扰。在加入ＣＴＡＢ缓冲液进行温浴时，将时间延长至２ ｈ能更好地处理多糖、酚类及其他杂质，所获得的ＤＮＡ质量也将较高。

６）在提取过程中，采用常规ＣＴＡＢ法常出现多酚类物质的褐化现象，使ＤＮＡ溶液颜色产生浑浊。β－巯基乙醇具有抗氧化作用，在改良ＣＴＡＢ法中，提取液中加入１％ β－巯基乙醇可以有效地去除植物组织内的多糖物质和多酚类物质，防止酚类物质造成褐化现象。

７）ＰＣＲ技术对ＤＮＡ样品量和纯度的要求均不高，但因ＰＣＲ具有很高的灵敏度，为防止试剂交叉污染，应尽量减少提取步骤；采用改良的ＣＴＡＢ法提取大戟属植物ＤＮＡ，能够获得高质量的ＤＮＡ样品。

８）在ＤＮＡ提取过程中，用异丙醇沉淀时，若异丙醇未挥发尽，会直接影响Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶的活性，试验中应该让异丙醇沉淀离心后充分挥发。

９）在ＤＮＡ提取过程中，氯仿是蛋白的有效沉淀剂，对Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶有变性作用。

１０）ＤＮＡ沉淀出现后，絮状沉淀不一定全是ＤＮＡ沉淀，判断絮状沉淀的标准是看其是否易溶于ＴＥ，若易溶则说明其杂质含量较少，若难溶则说明其杂质含量较高，纯度较差。而ＴＥ溶解是一个比较缓慢的过程，为了充分溶解，通常在４℃条件下溶解１ ｄ。

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