HPLC法测定石蒜中加兰他敏含量的方法研究

江海 曹小勇 吴三桥等

摘要：建立了测定石蒜中加兰他敏含量的高效液相色谱法。以梯度乙腈－０．２%磷酸为流动相，Ｅｃｌｉｐｓｅ ＸＤＢ－Ｃ１８（４．６ ｍｍ×１５０ ｍｍ，５ μｍ）为固定相，流速为１ ｍＬ／ｍｉｎ，柱温为２０ ℃，检测波长为２８９ ｎｍ，对加兰他敏进行分析。结果表明，加兰他敏在该色谱条件下与其他组分均能有效分离，符合分析条件。

关键词：高效液相色谱；加兰他敏；石蒜；含量

中图分类号：Ｏ６５７．７＋２文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）16－3389-03

Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇａｌａｎｔｈａｍｉｎｅ ｉｎ Ｌｙｃｏｒｉｓ ｒａｄｉａｔａ ｂｙ ＨＰＬＣ

ＪＩＡＮＧ Ｈａｉ１，２，ＣＡＯ Ｘｉａｏ－ｙｏｎｇ２，ＷＵ Ｓａｎ－ｑｉａｏ１，ＬＩ Ｘｉｎ－ｓｈｅｎｇ１，ＬＩ Ｚｉ－ｘｕａｎ２，ＷＡＮＧ Ｙｕ－ｔｉｎｇ２

（１． Ｓｈａａｎｘｉ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｂｉｏ－ｒｅｓｏｕｒｃｅ， Ｈａｎｚｈｏｎｇ ７２３０００， Ｓｈａａｎｘｉ， Ｃｈｉｎａ；

２． Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｓｈａａｎｘｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｈａｎｚｈｏｎｇ ７２３０００， Ｓｈａａｎｘｉ， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ａｎ ＨＰＬＣ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ａｎａｌｙｚｉｎｇ ｇａｌａｎｔhａｍｉｎｅ ｉｎ Ｌｙｃｏｒｉｓ ｒａｄｉａｔａ ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ． Ｅｃｌｉｐｓｅ ＸＤＢ－Ｃ１８（１５０ ｍｍ×４．６ ｍｍ，５ μｍ） ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｓｅｐａｒａｔｅ ｔｈｅ ａｎａｌｙｔｅ ｗｉｔｈ ａ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ ｏｆ Ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ ａｎｄ ０．２％ Ｈ３ＰＯ４ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｗｉｔｈ １ ｍＬ／ｍｉｎ ａｔ ２０ ℃， ｔｈｅ ｓａｍｐｌｅ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ａｔ ２８９ ｎｍ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｇｏｏｄ ｆｏｒ ｓｅｐａｒａｔｉｎｇ ａｎｄ ａｎａｌｙｚｉｎｇ ｇａｌａｎｔａｍｉｎｅ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ＨＰＬＣ； ｇａｌａｎｔhａｍｉｎｅ； Ｌｙｃｏｒｉｓ ｒａｄｉａｔａ； ｃｏｎｔｅｎｔ

石蒜（Ｌｙｃｏｒｉｓ ｒａｄｉａｔａ）别名老鸦蒜，龙爪花，属于石蒜科石蒜属，多年生草本，叶带状，深绿色带白霜粉，分布于长江流域以南各省区，喜生于林缘、河岸阴湿处［１］。该属植物花朵色泽鲜艳，其品种众多，有红花、粉红花、黄花、淡红紫色、百合型、白长筒型等，形态别致，是一种具鳞茎的花卉植物，具有良好的观赏价值。石蒜鳞茎含淀粉，可提取植物胶代阿拉伯胶。全草含石蒜碱、加兰他敏等生物碱，具有镇静、镇痛、解热、降压、抗炎、催吐、抗病毒、抗癌等作用［２］。

陕西汉中是石蒜的适生地，在当地作为一种民间药材，已有悠久的使用历史。但另一方面，石蒜的品种繁多，不同种中的有效成分含量不一，如何科学评价石蒜中的有效成分，是开发石蒜药用价值的关键内容之一。石蒜中加兰他敏具有治老年痴呆症的功效，目前其测定方法包括：分光光度法［３］、荧光分光光度法［４］、薄层扫描法及高效液相色谱法等［５－９］。本研究对石蒜中的加兰他敏采用高效液相色谱法测定其含量，分析时间短，操作简单，能够有效测定石蒜中加兰他敏的含量，将为开发石蒜的药用价值提供基础依据。

１材料与方法

１．１材料

石蒜样品２００８年８月采于陕西省西乡县，经８０℃烘干、粉碎，过６０目分样筛，备用。

１．２仪器

高效液相色谱仪Ａｇｉｌｅｎｔ １１００（美国安捷伦公司）；ＳＫ－１２０Ｅ超声波提取仪（宁波科生仪器有限公司）；ＵＶ－２５５０紫外－可见分光光度计（日本岛津公司）；ＴＴＬ－１０Ａ超纯水器（北京同泰联科技发展公司）；３０２型电热恒温鼓风干燥箱（山东潍纺医药集团股份有限公司医疗器械厂）；ＦＷ１１７型中草药粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；ＡＵＷ２２０Ｄ十万分之一分析天平（日本岛津公司）；ＦＡ２００４Ｎ万分之一电子天平（上海分析仪器）；ＴＤ２４－低速台式离心机（长沙湘仪器有限公司）；Ｇ８０Ｄ２３ＹＳ２－Ｑ６微波炉（格兰仕微波炉电器有限公司）；电热板（北京科伟永兴仪器有限公司）。

１．３试剂

甲醇、氯仿、磷酸、氨水为分析纯，乙腈为色谱纯；加兰他敏标准品（纯度为９９．８％，ＳＩＧＭＡ公司）。实验用水为纯水仪制备的去离子水。

１．４方法

１．４．１检验波长选择取加兰他敏标准品适量，用去离子水配成标准溶液，在１９０～９００ ｎｍ之间扫描其吸收图谱。

１．４．２色谱条件色谱柱：Ｅｃｌｉｐｓｅ ＸＤＢ－Ｃ１８柱（４．６ ｍｍ×１５０ ｍｍ，５ μｍ）；检测波长：２８９ ｎｍ；流动相：不同体积比的乙腈－０．２%磷酸梯度洗脱，即：０ ｍｉｎ（９７∶３）－５ ｍｉｎ（９０∶１０）－８ ｍｉｎ （８０∶２０）-１０ ｍｉｎ（９７∶３）；流速：１ ｍＬ／ｍｉｎ；柱温：２０ ℃。

１．４．３标准溶液的制备精密称取５．０ ｍｇ加兰他敏标准品，用去离子水溶解，定容于１０ ｍＬ容量瓶中。制得加兰他敏标准品０．５ ｍｇ／ｍＬ的标准母液［１０］。

１．４．４线性范围考察精密吸取加兰他敏标准品母液０．２５、０．５、０．７５、１．０和１．２５ ｍＬ，用去离子水定容至５．０ ｍＬ容量瓶，制备不同浓度的加兰他敏标准溶液，经０．４５ μｍ微孔滤膜过滤，按上述色谱条件分别进样１０ μＬ，测定标准溶液的峰面积。以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，拟合绘制标准曲线。

１．４．５样品溶液的制备称取干燥石蒜粉末１ ｇ于８０ ｍＬ烧杯中，加入２５ ｍＬ甲醇，在常压下进行微波提取。间隔３０ ｓ后取出用冷水冷至室温，然后重复微波提取，直至累计提取时间达１０ ｍｉｎ。待提取液冷至室温后，以４ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心５ ｍｉｎ，取上清液于水浴５０ ℃蒸干，残渣溶于５ ｍＬ ０．５ ｍｏｌ／Ｌ盐酸，离心，取上清液，用氨水调ｐＨ值至１０，然后用氯仿萃取３次，每次１０ ｍＬ，合并氯仿液，水浴５０℃蒸干，残渣用去离子水溶解并定容于５ ｍＬ容量瓶中［１１，１２］。过０．４５ μｍ微孔滤膜后进行色谱分析，同时进行精密度、稳定性、重现性以及回收率实验。

２结果与分析

２．１检测波长

根据其紫外－可见吸收光谱，加兰他敏标准品在２２４、２３２和２８９ ｎｍ处存在最大吸收光谱，参照早期研究［７－９］，本实验选用２８９ ｎｍ为检测波长。

２．２线性范围

标样色谱图见图１，根据不同浓度标准品的峰面积，计算得其线性回归方程为：ｙ＝４６．２ｘ＋２９６．９，ｒ＝ ０．９９９ ８，表明加蘭他敏在０．２５～１．２５ μｇ范围内线性关系良好。

２．３精密度试验

精密吸取上述供试样品溶液１０ μＬ，连续进样５次，测定加兰他敏峰面积，得结果分别为４ ９０７、

４ ９５１、４ ９４６、４ ９１５、４ ９８８，ＲＳＤ为０．６５％（ｎ＝５）。

２．４稳定性实验

精密吸取上述供试样品溶液１０ μＬ，分别在２、４、８、２４和４８ ｈ进样测定加兰他敏的峰面积，ＲＳＤ为１．０８％（ｎ＝５）。结果表明供试品溶液中的加兰他敏在４８ ｈ内稳定。

２．５重现性实验

取同一材料，按１．４．５的制备方法平行制备５份，依法测定加兰他敏的峰面积，其ＲＳＤ值为１．４８％（ｎ＝５）。

２．６回收率试验

分别称取已知加兰他敏含量的石蒜样品１．０ ｇ，共５份，加入２５．００ μｇ／ｍＬ的加兰他敏标准品１ ｍＬ，按１．４．５样品溶液制备的方法操作，并做色谱分析。结果（表１）表明，加兰他敏的平均回收率为１００．３％，ＲＳＤ值为０．３７％（ｎ＝５）。

２．７样品材料测定结果

按上述供试液制备方法及色谱条件分别提取和测定３批石蒜样品，利用外标峰面积法测定样品中加兰他敏的含量，结果见表２。

３讨论

１）在本试验中，我们首先考察了加兰他敏的提取方法。采用６ ｍｏｌ／Ｌ的盐酸－３ ｍｏｌ／Ｌ氢氧化钠提取法在过滤和蒸干时较为困难，提取率低，峰形较差，难以用于定量分析；而用甲醇提取时，也存在提取物峰形差的问题；经过摸索，发现采用甲醇－氯仿法提取物的提取率高，重复性好，色谱峰形对称，所以后续试验采用该法进行提取。

２）在液相分析过程中，采用碱性流动相时，出峰时间在２０ ｍｉｎ之后，且峰形拖尾严重，峰形对称性差，基线不易走平，而以乙腈∶水（２２∶７８，Ｖ／Ｖ），含１％（Ｖ／Ｖ）三乙胺，醋酸调ｐＨ值为７．０；或者磷酸盐缓冲液（ｐＨ值为３～４）∶甲醇（体积比为９３∶７）以及体积比为２０∶８０的乙腈：水（含０．１％ＴＦＡ，Ｖ／Ｖ）等流动相进行洗脱时［１３］，保留时间在５ ｍｉｎ以内，将目标物与杂质分开。因此，最后选择不同体积比的０．２%磷酸－乙腈梯度洗脱，即：０ ｍｉｎ（９７∶３）－５ ｍｉｎ（９０∶１０）－８ ｍｉｎ（８０∶２０）－１０ ｍｉｎ（９７∶３），并采用能耐受酸性环境的Ｅｅｌｉｐｓｅ ＸＤＢ－Ｃ１８（５ μｍ，４．６ ｍｍ×１５０ ｍｍ）色谱柱，石蒜中各种成分分离较好，而且加兰他敏的峰形较好，重复性好，能有效检测石蒜中的加兰他敏，为科学评价石蒜中的有效成分提供了分析依据。

参考文献：

［１］ 张露，王光萍． 石蒜类植物无性繁殖技术［Ｊ］． 南京林业大学学报（自然科学版），２００２，２６（４）：１－５．

［２］ 邓传良，周坚． 石蒜属植物生物碱研究概况［Ｊ］． 中国野生植物资源，２００４，２３（６）：１３－１４．

［３］ 方玲，叶铭龙． 紫外分光光度法测定氢溴酸加兰他敏片的含量及含量均匀度［Ｊ］． 上海医药，１９９８，１９（９）：３５－３６．

［４］ 李霞，熊远福，蒋利华，等． 荧光法测定石蒜中加兰他敏含量［Ｊ］． 作物研究，２００６，２０（２）：１４９－１５０．

［５］ 李霞，熊遠福，蒋利华，等． 一步法测定加石蒜中加兰他敏和石蒜碱含量［Ｊ］． 化工进展，２００８，２７（６）：９０４－９０７．

［６］ 靳朝东． 用ＨＰＬＣ法快速测定石蒜科植物中的加兰他敏［Ｊ］． 国外医药（植物药分册），２００５（１）：１６．

［７］ 范华均，染伟，李攻科． 微波辅助提取／ＨＰＬＣ分析石蒜中的生物碱［Ｊ］． 分析测试学报， ２００６，２５（３）：２７－３０．

［８］ ＡＢＤＡＬＬＡＨ Ｏ Ｍ．Ｍｉｎｏｒ aｌｋａｌｏｉｄｓ fｒｏｍ lｙｃｏｒ ｉｓ sａｎｇｕｉｎｅａ［Ｊ］． Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９５，ｌ３９：４７７－４７８．

［９］ 吴芳丽，李爱珍，毛慧芳． ＨＰＬＣ测定石蒜中加兰他敏含量［Ｊ］． 中国中药杂志，２００５，３０（７）：５２３－５２５．

［１０］ 江海，吴三桥，李新生．利用ＨＰＬＣ法测定狼牙刺种子氧化苦参碱含量［Ｊ］． 江苏农业科学，２００８（６）：２４５－２４６．

［１１］ 王晓燕，黄敏仁，韩正敏．微波辅助提取石蒜属植物忽地笑中加兰他敏的研究［Ｊ］．南京中医药大学学报，２００５，２１（６）：３７４－３７５．

［１２］ ＫＩＴＡ Ｙ，ＧＹＯＴＥＮ Ｍ，ＮＡＫＡＪＩＭＡ Ｍ，ｅｔ ａｌ． Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｉｎｔｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｈｅｎｏｌｉｃ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｈｙｐｅｒｖａｌｅｎｔ ｉｏｄｉｎｅ（ＩＩＩ） ｒｅａｇｅｎｔ： Ｌｅａｄｉｎｇ ｔｏ ｇａｌａｎｔｈａｍｉｎｅ－ｔｙｐｅ ａｍａｒｙｌｌｉｄａｃｅａｅ ａｌｋａｌｏｉｄｓ［Ｊ］． Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９８，６３（１９）：６６２５－６６３３．

［１３］ 王晓燕，黄敏仁，韩正敏． 石蒜属植物中加兰他敏的分离提取及其应用［Ｊ］． 南京林业大学学报，２００４，２８（４）：７９－８３．