自体CIK细胞及DC细胞联合索拉非尼治疗晚期肝癌的临床观察

李建旺 彭大为 黄春珍 元建华

体内回输免疫活性细胞的过继免疫疗法是继手术、放疗、化疗之外的另一种重要的肿瘤治疗方法。细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced kiuer，CIK)兼具T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性和NK非MHC限制性杀瘤细胞功能，且体内外增殖能力强［1］，是一类杀瘤活性和杀瘤谱更强的新型抗肿瘤效应细胞。体内回输树突状细胞(dendritic cell，DC)是目前发现的功能最强的抗原提呈细胞，可有效激发T细胞应答［2］，有效抵制肿瘤细胞的免疫逃逸机制［3］。DC与CIK是肿瘤免疫治疗的2个重要部分，前者识别病原，激活获得性免疫系统，后者通过发挥自身细胞毒性和分泌细胞因子杀伤肿瘤细胞，两者联合确保了1个高效和谐的免疫反应的完成。本研究小组进行了自体DC-CIK细胞采用静脉回输联合索拉非尼治疗44例晚期原发性肝癌患者，并将其近期疗效报告如下。

1 材料与方法

1.1 病例选择

选择海口市人民医院肿瘤科2008年1月～2010年3月经检查确诊为晚期原发性肝癌的患者44例，经影像学确诊但无法行手术及放疗治疗。在DC-CIK治疗前进行索拉非尼分子靶向治疗，索拉非尼400 mg/次，2次/天，连续服用4周。12周为1个疗程，如无明显不良反应则重复疗程。治疗期间每周查血常规1次，每月查肝功能1次，白细胞计数＜3×109/L或肝功能异常时停药8周后进行评价，对药物反应性好及可耐受治疗者停药2～4周重复下一周期治疗。患者均签署知情同意书。索拉非尼分子靶向治疗与DCCIK治疗间隔时间在2周以上，患者肝病灶肿瘤2 cm×3 cm至14 cm×10.8 cm大小之间，含肝硬化、门静脉及下腔静脉癌栓、腹腔积液、黄疸、远处转移患者。

1.2 DC和CIK细胞培养和扩增

治疗细胞数量及重量模拟入院后行MRI检查，根据MRI确定肿瘤大小，计算出肿瘤体积。采血前24 h应用GM-CSF行外周血干细胞动员。

1.2.1 细胞分离 经CS-3000血细胞分离机分别采集患者的外周血5 L中的新鲜抗凝外周血单核细胞，再用聚蔗糖400(Ficoll 400)(中国科学院生物物理研究所)分离后经Hank’s液洗3次，收集纯度在90%以上的外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMNC)。

1.2.2 CIK细胞体外培养和扩增PBMNC 调整浓度为 1×106/L，第1天加入 rh-干扰素1 000 U/mL，第2天开始加入抗 CD3单抗 50 μg/mL，IL-1a 100 U/mL，IL-2 1000 U/mL，连续培养3天，更换含有上述因子的培养液1次，连续培养10～20天。每周2次测定白细胞增殖率和CD3、CD56阳性细胞率，当细胞数扩增达到设计目标，阳性目标细胞达到85%时，进行细胞治疗。

1.2.3 DC细胞的体外培养和扩增 将CS-3 000分离得到的PBMNC(调整浓度为1×106/L)培养2 h，弃上清，获得贴壁单核细胞，向每孔加入完全培养基，GM-CFS 100 ng/mL，IL-4 500 U/mL，培养 5 天后加入HSP复合物1 ng/mL，在培养7天后就可收集悬浮的DC。每份全血可收获1.2×108～2.0×108DC，无菌检验合格后，可以按方案给患者治疗。

1.2.4 DC和CIK细胞共培养 将致敏过的DC与未经致敏的DC计数后，以DC:CIK=1∶3的比例和CIK细胞混合，用CIK培养液培养产生DC-CIK细胞。DC-CIK共培养物和CIK细胞的增殖性能比较于共培养当日起用台盼蓝拒染法计数，动态观察 DC共培养物的表型变化，分别于细胞培养的第9天检测 DC表面标记 CD40，CD80，HLA-DR和第9，14天检测 CIK和 DC-CIK 共培养物表面标记 CD3，CD56，CD4，CD8。

1.3 治疗方案

患者口服索拉非尼治疗完成1个月，2周后回输CIK细胞和DC细胞，2～3次/周，一次回输CIK 1×1010～2×1012，DC 细胞 1×109～1×1010。

1.4 观测指标及疗效评估

观测指标包括瘤体变化、肿瘤标志物、免疫指标、生存期、症状、生存质量及不良反应等。疗效评估参照Recist对实体瘤疗效判定标准:以患者治疗前及治疗后1个月CT及B超检查结果进行对照比较，分为完全缓解(CR)、部分缓解(PR)、轻度缓解(MR)、稳定(SD)、进展(PD)，缓解 =CR+PR+MR［4］;临床症状评价根据其积分值，积分值下降≥2/3为显著改善，积分下降1/3为部分改善，积分下降＜1/3为无改善［4］;生存质量评价根据患者Karnofsky评分和体质量;不良反应以患者主诉为依据。

1.5 统计学处理

采用SPSS 11.1统计软件进行统计分析，率的比较采用χ2检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 CIK和DC-CIK培养结果

CIK和DC-CIK共培养的增殖活性细胞因子诱导的CIK细胞在培养中有较高的增殖，而DC-CIK共培养细胞具有更高的增殖活性。细胞在第3天后开始增殖，第5～6天快速增长，培养20 d时，CIK细胞和 DCCIK共培养的细胞增殖倍数分别为120和1000。CIK培养的第21天，效靶比为5∶1时，CIK对Bel-7404细胞的细胞毒活性为46.7%。

2.2 DC-CIK 细胞表型

第 9天 CD3+，CD56+细胞占4.89% ～6.92%，CD3+，CD8+细胞占48.2% ～51.3%;第14天 CD3+，CD56+细胞占 14.78% ～16.82.%，CD3+，CD8+细胞占76.2% ～78.3%;第21 天 CD3+，D56+细胞占46.89% ～56.92%，CD3+，CD8+细胞占 68.4%～88.5%，见表 1。

表1 CIK细胞免疫治疗前后患者外周血免疫学指标变化(s，%)

表1 CIK细胞免疫治疗前后患者外周血免疫学指标变化(s，%)

免疫指标 治疗前 治疗后 P值CD3+ 42.72 ±7.34 71.38 ±9.25 ＜0.01 CD4+ 24.33 ±2.98 35.77 ±4.38 ＜0.01 CD8+ 21.36 ±3.47 28.29 ±2.76 ＜0.05 CD4+/CD8+ 1.37 ±0.26 1.58 ±0.12 ＜0.05 CD16 5.45 ±0.38 9.24 ±0.66 ＜0.01 CD56 23.84 ±5.17 26.41 ±4.05 ＜0.05

2.3 疗效观察

患者经1个疗程DC-CIK静脉回输治疗后自觉症状改善，食欲增强，睡眠改善，疼痛减轻，体重无明显下降，体力较前好转，见表2。索拉非尼治疗的不良反应减轻，腹腔积液吸收，黄疸完全消退，转氨酶治疗后恢复正常，肿瘤生长缓慢，右肝病灶减少15%。索拉非尼联合1个疗程DC-CIK治疗后CR 0例，PR 15例，MR 22例，SD 5例，PD 2例，总缓解率为84.1%。

表2 44例患者CIK免疫治疗前后患者临床症状改善分析

2.4 不良反应

不良反应一般在回输1～2 h出现。存在不同程度的发热，其中低热8例，高热2例，持续时间在2～8 h，除1次采用解热镇痛药外，其余均自行消退。回输后行血常规、肝肾功检查，均未发现明显改变。

3 讨论

原发性肝癌具有起病隐匿、病程短、进展快、程度高、生存期短等特点，发现时多属晚期，故临床治疗难度大，患者生活质量差，病死率高，严重危害着人类的生命和健康。治疗肝癌的还有化疗、放疗方法以及其他多种治疗方法，如化学栓塞、皮下注射乙醇或乙酸和肝移植等，但是，这些治疗方法预后效果不甚理想。

索拉非尼(sorafenib)，商品名:多吉美，是1种多靶点的抗肿瘤药物，属多激酶抑制药。索拉非尼具有双重抗肿瘤效应，一方面，它可以通过抑制 RAF/MEK/ERK信号传导通路，直接抑制肿瘤生长;另一方面，它又可通过抑制VEGFR和PDGFR而阻断肿瘤新生血管的形成，间接抑制肿瘤细胞的生长。

一个大样本的安慰药对照的索拉非尼治疗肝癌的方案:索拉非尼组 PR占2.3%，安慰药组为0.7%，SD分别为 71.0% 和 67.0%，PD 分别为18.0% 和24.0%;4个月无恶化率分别为 62.0%和42.0%，中位恶化时间分别为24.0 和 12.3 周(P ＜0.01)［5］。

我国原发性肝癌的主要病因是乙型肝炎病毒慢性感患者均存在不同程度的免疫功能缺陷，这可能与机体外周血中DC数量减少，功能减低有关。有实验证实，肝癌患者CIK的增殖速度较正常人慢，且增殖倍数也有所降低［6］，体内注射DC细胞，DC与T细胞结合后，大量分泌IL-12，诱导Th1型应答，有利于肿瘤清除。DC尚能分泌多种趋化因子，作用于初始T细胞，增强T细胞活性。DC与CIK共培养后产生的细胞群体比同原CIK细胞具有更强的增殖活性。CIK与DC相结合，不仅提高了CIK细胞的细胞毒作用，也能显著提高DC的功能［7］。DC与CIK混合培养时，两者能相互调节而增加细胞因子释放和增强细胞毒性，显著提高CIK细胞的增殖能力和杀伤活性，临床治疗效果优于CIK等其他效应细胞。

由于过继免疫治疗效果与效应细胞的治疗次数和投给数量有关，适当增加治疗次数和数量，可进一步提高疗效。本研究小组平均治疗3周，细胞总数达到了个性化设计的数量。CIK-DC细胞联合治疗，患者症状明显改善，生活质量提高，索拉非尼副反应减轻，显示对不宜进行手术或化疗晚期的肝癌患者具有改善症状、提高生活质量的作用，但远期疗效及其对患者生存期的影响，仍需长期随访。本例在回输过程中，有2次寒战、发热，无其他明显不良反应，患者发热原因可能是在回输的DC-CIK悬液中含有IL-2和人血白蛋白之故，均可自行消退，无其他不适，充分说明DC-CIK治疗的安全性［8］。这种典型的个性化生物治疗模式，具有独特的优势和良好的抗肿瘤作用，为肝癌患者的治疗提供了新的治疗手段。

［1］张有顺，黄 玲，杨红玲，等.肝癌患者CIK细胞的诱导及对肝癌细胞毒作用的研究〔J〕.上海免疫学杂志，2003，23(3):201.

［2］Banchereaul J，Steinman R.Dendritic cells and the control of immunity〔J〕.Nature，1998，392:245.

［3］Schott M，Seisslar J.Dendritic cell vaccination:new hope for thetreatment of metastasized endocrine malignancies〔J〕.Trends Endocrinal Metab，2003，14(4):156.

［4］鲍 锋，徐 岩，尹富华，等.CIK细胞过继免疫治疗中晚期恶性肿瘤的临床研究〔J〕.辽宁医学杂志，2003，17(4):187.

［5］Simpson D，Keating GM.Sorafenib:in hepat ocellularcarcinoma〔J〕.Drugs，2008，68(2):251.

［6］杜清友，刘明旭，王福生，等.CIK细胞体内外抗肝癌细胞应用〔J〕.中国癌症杂志，2001，11(4):325.

［7］Wang QJ，Wang H，Pan K，et al.Comparative study on antitumor immune response of autologous cytokine-induced killer(CIK)cells，dendritic cells-CIK(DC-CIK)，and semi-allogeneic DC-CIK〔J〕.Chin J Cancer，2010，29(7):641.

［8］Shi M，Zhang B，Tang ZR，et al.Autologous cytokine-induced killer(CIK)cell therapy in clinicaltrial phase I is safe in patients with primaryhepatocellular carcinoma〔J〕.World J Gastroenterol，2004，10(8):1146.