雌激素受体a基因启动子甲基化在卵巢上皮癌中表达的意义

刘曼华 王 莹

大量流行病学调查显示，雌激素在卵巢上皮肿瘤的病程进展中起重要作用。雌激素受体a(estrogen receptor alpha，ERa)是重要的肿瘤抑制基因，体外实验表明，雌激素受体a表达可抑制细胞增生，具有一定的抗癌作用［1］。雌激素受体(estroqen receptor，ER)是抗雌激素类药物内分泌治疗的靶点，也是预后的重要指标［2，3］。

为探讨卵巢上皮癌中ERa基因CpG岛甲基化状况及与其生物学行为及预后的关系，我们采用甲基化特异性PCR(methylation specific PCR，MSP)检测，正常卵巢组织、良性卵巢肿瘤和卵巢癌组织中ERa基因启动子CpG岛的甲基化状态，分析卵巢癌ERa启动子甲基化与其临床病理特征的关系，进一步探讨ERa启动子甲基化作为卵巢癌临床诊断和治疗的分子标志物的可能性，并为卵巢癌的去甲基化治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 标本来源

南通大学第二附属医院病理科提供新鲜组织标本，包括10例正常卵巢组织、20例良性组织和64例卵巢癌组织，经病理检查证实的卵巢癌标本64例，其中33例浆液性腺癌(SAC)、20例黏液性癌、9例子宫内膜样腺癌(MAC)、2例透明细胞癌(CCA)。卵巢癌按FIGO 2000标准分期:Ⅰ～Ⅱ期(早期)19例，Ⅲ～Ⅳ期(晚期)45例。病理学分级:G1～G2级为高分化，共22例，G3级为低分化，共42例。上皮性卵巢癌患者年龄33 ～76岁，平均53.8岁，淋巴结转移34例，无淋巴结转移30例。10例正常卵巢组织取自因子宫疾病或卵巢良性病变切除的卵巢组织，患者年龄36～62岁，平均53.2 岁。

1.2 引物、主要试剂和仪器

ERa基因序列号为xM 000125，各个引物序列(表1)见参考文献［4］，均由上海生物工程公司合成。DNA抽提试剂盒购自德国QIAamp生物技术有限公司。DNA亚硫酸钠修饰试剂盒购自美国CHEMICON公司。Hot StarTap酶购自QIAamp生物技术有限公司。PCR反应体系自行配置。野生型引物w扩增未修饰的启动子区。非甲基化引物u、甲基化引物m分别扩增经修饰后的非甲基化和甲基化启动子区。PxZ型PCR扩增仪为 Thermo Hybaid公司产品，BioSens SC620型紫外凝胶分析系统为上海山富科学仪器有限公司产品。

表1 ERa基因引物序列及PCR反应条件

1.3 PCR 反应

1.3.1 DNA提取 新鲜组织标本，按DNA抽提试剂盒提取DNA，并测定DNA浓度和含量。

1.3.2 DNA经亚硫酸钠修饰及纯化 按照CHEMICON公司的DNA修饰试剂盒试验程序(Protocal)提示进行:相关试剂准备－1.0 μgDNA进行亚硫酸盐修饰－脱盐－再次脱盐并纯化－洗脱，最后洗脱DNA溶于30 μl BufferTE 溶液备用。

1.3.3 PCR反应体系、反应程序 50 μl反应体系:MgCl22.0 mmol/L，正向引物和反向引物 0.8 μmol/L，4种dNTP每种终浓度为0.4 mmol/L，TaqDNA聚合酶0.5 U，DNA 模板1 μg。反应条件:预变性 95℃5 min，变性 95℃ 30 s，退火(温度、时间见参考文献［4］)，72℃1 min，40个循环;72℃ 8 min延伸，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，紫外凝胶分析系统观察拍照。

1.3.4 PCR产物直接测序 提供启动子非甲基化引物和甲基化引物的PCR产物，由大连宝生物技术有限公司纯化和直接测序。

1.4 统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件，率的比较采用 χ2检验，根据χ2值计算Pearson列联系数，数字＜40采用Fisher’s精确法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ERa基因启动子区甲基化情况

10例正常卵巢组织中未见ERa基因启动子甲基化;20例卵巢良性肿瘤中ERa基因启动子甲基化发生率为10.00%(2/20);64例卵巢癌组织中ERa基因启动子甲基化发生率为53.13%(34/64)，ERa基因启动子甲基化发生率卵巢癌、卵巢良性肿瘤与正常卵巢组织间比较，差异均有统计学意义(P＜0.05);卵巢癌与卵巢良性肿瘤比较及卵巢良性肿瘤与正常卵巢组织比较，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表2。

正常组织、良性卵巢组织和卵巢癌组织中均有扩增产物出现，野生型引物(w)、非甲基化引物(u)和甲基化引物(m)的PCR扩增结果见图1。

表2 不同卵巢组织中ERa基因启动子区甲基化状态

图1 不同卵巢组织中ERa基因甲基化表达图

2.2 ERa基因启动子甲基化与卵巢癌临床病理特征的关系

上皮性卵巢癌组织中ERa基因启动子甲基化发生率，浆液性癌与黏液性癌比较差异无显著性(Fisher’s=0.208，P ＞0.05)，内膜样癌中其甲基化率最高，与其他几种类型比较差异显著(P＜0.05)。高分化、中分化癌中ERa基因启动子区甲基化率显著低于低分化癌(Fisher’s=0.044，P ＜0.05);但高分化与中分化比较无统计学意义(Fisher’s≥0.05，P≥0.05);Ⅰ期、Ⅱ期卵巢癌组织其发生率显著低于Ⅲ期和Ⅳ期((Fisher’s=0.019，P ＜0.05)，且肿瘤大小、盆腔淋巴结是否发生转移与ERa启动子甲基化无显著相关性(P ＞0.05)，见表3。

2.3 ERa基因启动子甲基化与卵巢癌发生的关系

ERa基因启动子甲基化患者，患卵巢癌的风险增加5.68倍;晚期患者ERa基因启动子甲基化率增高，危险性明显增大(表3，表4)。

表3 ERa基因启动子甲基化与上皮性卵巢癌临床病理特征的关系(例，%)

表4 ERa基因启动子甲基化与卵巢癌发生的关系(例)

3 讨论

DNA甲基化作为表观遗传学是被人们最早发现的1种调控机制，它与肿瘤的发生有着密切关系。在肿瘤细胞中，异常甲基化最大的特点是全基因组的低甲基化和局部性(CpG岛)高甲基化并存［5］。最重要的甲基化碱基是胞嘧啶，通常发生在启动子区CpG岛区域。研究发现CpG岛甲基化可以抑制启动子序列的基因表达。

上皮性卵巢癌(占卵巢肿瘤的90%)是最常见的妇科恶性肿瘤之一，临床上使用标准的或经验治疗方法并未降低患者的发病率或死亡率。大多研究针对卵巢上皮肿瘤及其亚型—浆液性(占80% ～90%)、子宫内膜样、透明细胞癌进行。病理条件下长期过度的雌激素刺激是卵巢癌发生、病情恶化的重要因素［6，7］。在实验条件下对抗雌激素及其受体的活性可抑制某些卵巢癌细胞的生长［8］，且已有试验证明在乳腺癌中，甲基转移酶抑制剂可以恢复对内分泌治疗的敏感性［9］。ERa在上皮性卵巢癌病理进程中发生作用的方式尚不清楚，但已有试验证明在卵巢癌和交界性卵巢肿瘤中存在ERa基因甲基化现象［10］。

本研究中，检测64例不同类型的卵巢上皮恶性肿瘤中ERa基因表达情况，对ERa表达与卵巢癌临床病理特征的关系进行分析，观察到子宫内膜样癌中ERa甲基化阳性率为77.78%，与浆液性卵巢癌有统计学差异，所以临床上子宫内膜样癌预后较浆液性癌差［11］，且为卵巢子宫内膜样癌的内分泌治疗提供依据［12］。Fujimura 等［13］同样观察到，CCA 中 ERa、PR 的表达均明显低于其他类型卵巢癌，其中ERa在CCA标本及细胞系中的表达均为阴性，这与我们的研究结果相同，提示CCA与SAC中ERa及PR发挥作用的方式可能不同，说明ERa基因甲基化是其失活的1种重要机制。卵巢癌中ERa、PR间存在的调控方式，有待从分子生物学及细胞学等方面进一步研究其调控机制。

本实验中有2例卵巢良性肿瘤组织发生甲基化，推测可能有小部分肿瘤细胞有恶变潜能或癌前细胞出现在正常组织中，与Makarla等［14］的研究结论相一致，并且这些卵巢良性肿瘤或许已经有了潜在恶性行为。推测该病例可能存在卵巢癌的危险因素，且可能与早期高雌激素水平的长期暴露有关，建议定期复查。

我们研究还发现，ERa基因启动子区甲基化的发生与细胞分化程度和临床分期有关，多发生在低分化者和临床Ⅲ、Ⅳ期的患者，而且随着疾病的进展，这种分子状态将持续存在。高分化组和中分化组ERa基因甲基化的发生率明显低于低分化组，提示ERa基因甲基化与卵巢癌的细胞分化程度密切相关，卵巢癌细胞分化程度越低，ERa基因的甲基化频率就越高。临床Ⅰ、Ⅱ期ERa基因甲基化的发生率也明显高于低于Ⅲ、Ⅳ期，据此，可以推测ERa基因是与早期卵巢癌发生发展相关的重要抑癌基因之一，主要由于启动子区异常甲基化而导致其表达失活，晚期卵巢癌ERa基因发生高甲基化导致对抗雌激素药物的不敏感，这或许可以解释晚期卵巢癌内分泌治疗疗效差的原因，我们可以设想对于早期卵巢癌或许内分泌治疗会得到良好疗效。

本实验检测卵巢癌组织中ERa基因的发生甲基化，推测可同时测定循环肿瘤标记物以提高诊断率;而且它们在各种类型的卵巢癌中均达，提示可用于卵巢癌的筛查;我们在研究ERa基因与卵巢癌的关系时发现，ERa基因甲基化患者患卵巢癌的风险增加5.68倍;且晚期甲基化率明显增高，提示测这个抑癌基因的异常甲基化可用于卵巢癌的早期临床诊断。

本研究结果显示，ERa启动子甲基化率与卵巢癌淋巴结转移与否及肿瘤大小无显著相关性，提示ERα基因甲基化与卵巢癌的转移潜能无关。对于早期卵巢癌的发生或许与雌激素长期刺激有关，ERa启动子甲基化外，或者还有其他一些机制参与，DNA甲基化并不是其蛋白失表达的唯一机制，而是多种机制共同参与的结果。

总之，我们通过对卵巢肿瘤中ERa基因甲基化的检测，并结合临床病理特征进行初步分析，结果显示:子宫内膜样癌与浆液性卵巢间ERa甲基化表达阳性率最高，与其他几种病理类型存在差异，同时发现ERa基因甲基化与临床分期有密切关系，可能成为临床治疗和评估预后的一项参考指标。由于近年来，应用DNA甲基化标志进行临床癌症检测和诊断已经取得了显著的进展。检测ERa启动子区的甲基化状态，因其具有高灵敏度，操作简便，快速，检测标本要求低等特点，可以作为卵巢癌早期诊断、分型、复发的生物学指标，选择内分泌治疗的预测因子以及提高内分泌治疗有效，也可能成为检测预后的一个重要指标。去甲基化药物可以使卵巢癌细胞的ERa恢复表达，恢复对抗雌激素疗法的敏感性，从而提高卵巢癌内分泌治疗的有效率［15］。

［1］Nass SJ，Herman JG，Gabrielson E，et al.Aberrant methylation of the estrogen receptor and E-cadherin 5＇CpG islands increases with malignant progression in human breast cancer〔J〕.Cancer Res，2000，60(16):4346.

［2］Kurebayashi J.Current clinical trials of endocrine therapy for breast cancer〔J〕.Breast Cancer，2007，4(2):200.

［3］Lee A，Kim Y，Han K，et al.Detection of tumor markers including carcinoembryonic antigen.APC and cyclin D2 in fine-needle aspiration fluid of breast〔J〕.Arch Pathol Lab Med，2004，128(11):1251.

［4］Sasaki M，Tanaka Y，Perinchery G，et a1.Methylation and inactivation of estrogen progesterone，and androgen receptors in prostate cancer〔J〕.J Natl Cancer Inst，2002，94(5):384.

［5］Ushijima T.Detection and interpretation of altered methylation patterns in cancer cells〔J〕.Nat Rev Cancer，2005，5(3):223.

［6］Cunat S，Hoffmann P，Pujol P.Estrogens and epithelial ovarian cancer〔J〕.Gynecol Oncol，2004，94(1):25.

［7］Wilson ME，Westberry JM.Regulation of oestrogen receptor gene expression:new insights and novel mechanisms〔J〕.J Neuroendocrinol，2009，21(4):238.

［8］Katzenellenbogen BS，Katzenellenbogen JA.Estrogen receptor transcription and transactivation:estrogen receptor alpha and estrogen receptor beta:regulation by selective estrogen receptor modulators and importance in breast cancer〔J〕.Breast Cancer Res，2000，2(5):335.

［9］Fan J，Yin WJ，Lu JS，et al.ER alpha negative breast cancer cells restore response to endocrine therapy by combination treatment with both HDAC inhibitor and DNMT inhibitor〔J〕.J Cancer Res Clin Oncol，2008，134(8):883.

［10］Wiley A，Katsaros D，Chen H，et al.Aberrant promoter methylation of multiple genes in malignant ovarian tumors and in ovarian tumors with low malignant potential〔J〕.Cancer，2006，107(2):299.

［11］Tothill RW，Tinker AV，George J，et al.Novel molecular subtypes of serous and endometrioid ovarian cancer linked to clinical outcome〔J〕.Clin Cancer Res，2008，14(16):5198.

［12］Geisler JP，Buller E，Manahan KJ.Estrogen receptor alpha and beta expression in a case matched series of serous and endometrioid adenocarcinomas of the ovary〔J〕.Eur J Gynaecol Oncol，2008，29(2):126.

［13］Fujimura M，Hidaka T，Kataoka K.Absence of estrogen receptor alpha expression in human ovarian clear cell adenocarcinoma compared with ovarian serous，endometrioid，and mucinous adenocarcinoma〔J〕.Am J Surg Pathol，2001，25(5):667.

［14］Makarla PB，Saboorian MH，Ashfaq R，et al.Promoter hypermethylation profile of ovarian epithelial neoplasms〔J〕.Clin Cancer Res，2005，11(5):5365.

［15］Giacinti L，Claudio PP，Lopez M，et a1.Epigenetic information and estrogen receptor alpha expression in breast cancer〔J〕.Oncologist，2006，11(1):1.