血清透明质酸在梗阻性黄疸肝损伤模型中的变化及其意义

2011-11-15任昌安李文星阎慧明商中华韩曙光中国人民解放军总医院肝胆外科医院全军肝胆外科研究所北京00853山西医科大学第二临床医学院普通外科通讯作者maildoctorlb63com

山西医科大学学报 2011年7期

梁斌，任昌安，李文星，阎慧明，商中华，韩曙光 (中国人民解放军总医院肝胆外科医院，全军肝胆外科研究所，北京 00853;山西医科大学第二临床医学院普通外科;通讯作者，E-mail:doctorlb@63.com)

梗阻性黄疸是指由于肝外胆管梗阻所致的胆汁淤积性疾病，可导致严重的全身性的病理生理改变［1］。研究显示肝窦内皮细胞在肝脏微循环中具有重要的调节作用［2－5］，并具有吞噬清除、合成细胞外基质及脂质代谢等功能，在梗阻性黄疸肝脏损伤中起到重要作用［6，7］，而有关梗阻性黄疸时肝窦内皮细胞的损伤报道较少。本文动态观察梗阻性黄疸后血清透明质酸变化及其与中性粒细胞聚集之间的关系，对肝窦内皮细胞的损伤及机制作深入探讨。

1 材料与方法

1.1 实验分组及模型制作雄性健康Wistar大鼠60只，体重250－300 g，由山西医科大学动物实验中心提供。动物随机分为:胆总管结扎组和假手术组(只游离胆总管但不结扎组)，每组各30只。胆总管结扎组根据术后不同的时间分为1 d，3 d，7 d，14 d，21 d 共 5 个小组，分别记为 OJ1，OJ3，0J7，OJ14，OJ21，每组6只。大鼠均常规喂养，术前12 h禁食，不禁水，采用3%戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔注射麻醉，备皮消毒后，取上腹正中纵切口，长约3 cm，寻找胆总管并于近肝门处0#丝线行三重结扎，在近端两处和远端一处间剪断。假手术组只游离胆总管，不结扎离断胆总管，与胆总管结扎组类似，按术后1 d、3 d、7 d、14 d、21 d 不同时间点分为5 个小组，分别 SM1、SM3、SM7、SM14、SM21。各组在相应的时间点，经腹主动脉抽取血液，离心后将血清保存于－20℃冰箱待测;取血后，切取不同部位肝脏组织3块，分别用于髓过氧化物酶测定、组织病理学检测以及湿干比重测定。

1.2 仪器与试剂分析天平、Olympus光学显微镜、722分光光度仪、NS-648型放射免疫γ计数器。透明质酸放射免疫测定盒(上海海研医学生物技术中心)、肝脏组织髓过氧化物酶(MPO)、谷丙转氨酶、血清总胆红素、血清肌酐检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.3 血清透明质酸及其他血清学指标测定血清透明质酸测定采用放射免疫法;血清谷丙转氨酶:赖氏法;血清总胆红素:固兰B法;血清肌酐:苦味酸不除蛋白法。MPO测定:取冰冻新鲜肝脏组织样本，制备成浓度为5%的组织匀浆，然后加入H2O2显色剂，水浴后立即在460 nm处测定OD值。具体方法参照MPO测试盒说明。MPO活力以37℃反应体系中H2O2被分解1 μmol为1个活力单位。MPO活性(U/g)=(测定管 OD值－对照管 OD值)/11.3×取样量。以上各指标的检测均严格按照说明书进行操作。

1.4 组织病理学检查切取大鼠部分肝脏，经10%的中性甲醛固定24 h，常规石蜡包埋、切片、HE染色。在高倍镜下(HPF×1 000)随机取50个视野行双盲法中性粒细胞计数，以评价其聚集程度。

1.5 肝脏组织湿干比切取部分肝脏标本，置于55℃的烘箱内烘烤至少72 h或者至取得一恒定数值为止。肝脏组织湿干比=肝脏湿重/干燥后重量。1.6统计学分析所有数据均用±s表示，采用SPSS10.0软件分析，采用One-way ANOVA进行方差齐性检验，组间比较采用SNK-q检验。

2 结果

2.1 血清总胆红素和谷丙转氨酶假手术组各时间点血清总胆红素及血清谷丙转氨酶之间没有明显变化(P＞0.05)，故未将SM各组数据列出，而将其作为一整体与OJ各组进行比较。与假手术组相比，胆总管结扎组血清总胆红素于胆总管结扎后1 d即明显增高(P＜0.01)，术后3 d达到高峰，其后保持在较高水平。胆总管结扎组血清谷丙转氨酶于术后1 d即明显增高(P＜0.01)，术后14 d血清谷丙转氨酶有所下降，但仍明显高于假手术组(P＜0.01)，见表1。

表1血清总胆红素和谷丙转氨酶的变化(±s)Tab 1 Changes of serum total bilirubin and serum alanine aminotransferase in obstructive jaundice group and sham operation group at different time points after operation(±s)

与假手术(SM)组相比，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

组别 n T-BIL/(μmol/L) ALT(IU/L)SM组30 4.04 ±0.77 19.00 ±5.59 OJ1 组 6 96.80 ±3.41＊＊ 243.00 ±23.08＊＊OJ3 组 6 165.70 ±8.02＊＊ 84.02 ±7.37＊＊OJ7 组 6 154.00 ±11.62＊＊ 116.64 ±10.78＊＊OJ14 组 6 149.57 ±10.88＊＊ 63.14 ±8.60＊＊OJ21 组 6 139.65 ±9.38＊＊ 33.58 ±7.77*

2.2 血清透明质酸和肌酐 ①假手术组血清透明质酸于术后1 d均明显高于该组术后其他时间(P＜0.01)，与胆总管结扎组相比较仍明显减少(P＜0.05)，见表2。胆总管结扎组血清透明质酸在术后3 d及其后的时间均明显高于相应的假手术组(P＜0.01)，术后 21 d 达到高峰(P＜0.01)，见表 2。②胆总管结扎组血清肌酐较假手术组增高明显(P＜0.05)，其高峰出现在手术后第3天。胆总管结扎组和假手术组组内血清肌酐未见明显变化(P＞0.05)，见表2。③胆总管结扎组血清透明质酸的增高早于血清肌酐的增高，且并未随其发生相应变化。

经相关分析显示胆总管结扎组血清透明质酸与血清肌酐变化之间无明显相关性(Pearson相关系数r双侧=－0.036，P=0.849)。

2.3 肝脏组织髓过氧化物酶含量及湿干比 ①肝脏组织中髓过氧化物酶反映中性粒细胞在肝脏内的聚集程度。随着手术时间延长，肝脏内中性粒细胞的聚集程度明显增加，见表3。②肝脏湿干比的变化显示胆总管结扎组较假手术组术后不同时间均有统计学差异，肝脏组织的水肿于21 d时达高峰，见表3。

表2血清透明质酸和肌酐的变化(±s，n=6)Tab 2 Changes of serum hyaluronic acid and serum creatinine in obstructive jaundice group and sham operation group at different time points after operation(±s，n=6)

同时间点与假手术组相比，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;同组与术后1 d比较，##P ＜0.01

术后天数 HA/(ng/ml)SM组 OJ组Cr/(mmol/L)SM组 OJ组1 d 157.28 ±18.12 213.45 ±10.25* 1.49 ±0.23 2.07 ±0.15*3 d 78.99 ±9.24## 256.19 ±18.20＊＊ 1.29 ±0.05 2.51 ±0.24*7 d 83.03 ±9.44## 229.82 ±32.39＊＊ 1.24 ±0.08 2.33 ±0.20*14 d 71.87 ±15.78## 236.68 ±20.38＊＊ 1.28 ±0.11 2.32 ±0.13*21 d 88.25 ±16.82## 449.74 ±66.65＊＊## 1.26 ±0.20 2.25 ±0.12*

表3肝脏组织髓过氧化物酶和湿干比的变化(±s，n=6)Tab 3 Changes of myeloperoxidase in liver tissue and ratio of wet and dry weight of liver in obstructive jaundice group and sham operation group at different time points after operation(±s，n=6)

同时间点与假手术组相比，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

术后天数 MPO(U/g)SM组 OJ组W/D SM组 OJ组1 d 0.57 ±0.08 0.87 ±0.05* 2.71 ±0.21 3.14 ±0.25*3 d 0.59 ±0.09 1.31 ±0.17＊＊ 2.81 ±0.16 3.12 ±0.04*7 d 0.61 ±0.09 1.44 ±0.16＊＊ 2.79 ±0.05 3.20 ±0.15*14 d 0.64 ±0.06 1.50 ±0.18＊＊ 2.66 ±0.12 3.27 ±0.11*21 d 0.60 ±0.08 1.62 ±0.19＊＊ 2.69 ±0.10 3.64 ±0.17*

2.4 光镜观察 ①HE染色:胆管梗阻急性期(术后1 d)可见肝脏充血水肿明显;其后早期肝细胞浊肿，水样变性或脂肪变性，肝细胞内少见胆色素颗粒，小胆管内不见胆栓形成，汇管区无明显改变。随梗阻时间延长，肝细胞变性较前为重，部分肝细胞坏死，肝细胞内可见胆色素沉着、枯否细胞增生、汇管区水肿、小胆管增生明显，管腔内可见胆栓形成，汇管区可见明显炎症细胞浸润及纤维组织增生。肝脏纤维化程度于术后21 d时肝脏纤维化最重。②假手术组各时间点肝组织内中性粒细胞聚集程度的差异无统计学意义(P＞0.05)，故未将SM各组数据列出，而将其作为一整体与OJ各组进行比较(见表4)。数据显示胆总管结扎组术后1 d中性粒细胞数即有增高，随着时间的延长胆总管结扎组中性粒细胞较假手术组明显增高。

2.5 相关分析胆总管结扎组血清透明质酸的变化分别与肝脏组织内髓过氧化物酶含量、中性粒细胞聚集程度呈正相关性(分别相关系数r=0.469，P=0.009，双侧;r=0.398，P=0.03，双侧)。

3 讨论

梗阻性黄疸后肝脏微循环障碍涉及对肝窦内皮细胞功能的评价，近年的研究显示通过血清透明质酸的变化可反映该细胞的功能改变［8，9］。血清透明质酸(hyaluronic acid，HA)是一种没有支链结构的高分子量黏多糖，由间质细胞合成，广泛存在于全身结缔组织中，代谢产生的HA可经淋巴系统进入血液循环。肝窦内皮细胞表面有HA受体，是清除血液中HA的主要部位，血清中的HA可特异性地被肝窦内皮细胞摄取和降解［10］，少量小分子由肾小球滤过。因此，HA的改变可用以反映肝窦内皮细胞的功能，显示肝脏微循环损伤状况［11］。

表4肝组织内中性粒细胞聚集程度(±s)Tab 4 Accumulation of polymorphonuclear leukocyte(PMN)in hepatic tissue in obstructive jaundice group and sham operation group at different time points after operation(±s)

与假手术组相比，＊＊P ＜0.01

组别 n PMN聚集程度(个/50HP)SM组30 32.40 ±4.69 OJ1 组 6 87.33 ±11.27＊＊OJ3 组 6 207.50 ±25.74＊＊OJ7 组 6 246.33 ±11.13＊＊OJ14 组 6 251.67 ±23.17＊＊OJ21 组 6 247.33 ±20.96＊＊

胆总管结扎组术后1 d血清HA及转氨酶增高迅速，肝脏出现充血，水肿，有片状坏死等急性改变;而假手术组早期血清HA明显升高(1 d)，其后快速下降并稳定在较低水平。可见，HA早期快速升高一次性胆管完全梗阻所造成的急性肝脏损伤以及手术创伤有关。胆总管完全结扎后3 d开始，血清透明质酸逐步增高，反映胆道完全梗阻后早期即可影响肝窦内皮细胞功能变化［12］。长时间的胆道梗阻(21 d)，大鼠血清透明质酸明显增高，并与梗阻性黄疸后肝脏纤维化程度相紊合。研究表明肝窦内皮细胞在肝脏纤维化过程中亦起一定的作用，表现为肝窦内皮细胞毛细血管化，并大量合成HA，因此临床中可检测血清 HA，用于肝纤维化的早期诊断［13］。本研究显示梗阻性黄疸发生过程中，HA的变化趋势与Cr的变化之间不具有相关性，其变化主要反映肝脏窦内皮细胞损伤的状况。

髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)存在于中性粒细胞的嗜天青颗粒中，约占细胞干重的5%，通过测定组织内MPO含量可用于推断组织中中性粒细胞的聚集程度。本实验通过测定肝脏组织中髓过氧化物酶的含量，以及结合形态学上观察肝脏组织中中性粒细胞的聚集程度，显示胆总管结扎组血清透明质酸的变化分别与肝脏组织内髓过氧化物酶含量、中性粒细胞聚集程度呈正相关性，表现为随着梗阻时间的延长，肝脏组织内中性粒细胞聚集程度增加，表明肝窦内皮细胞的损伤与胆道梗阻导致的活化的中性粒细胞聚集有关。

梗阻性黄疸过程中因内毒素血症的出现［14］，会使枯否细胞激活并产生一些前炎症因子，如TNF-α、IL-6等，这些前炎症因子将刺激中性粒细胞趋化因子和激活调节因子(IL-8、及细胞因子诱导的中性粒细胞趋化因子(cytokine-induced neutrophil chemoattractant，CINC)的释放［15］。加之，肝内胆管扩张，窦壁细胞肿胀，血管收缩和舒张物质失平衡以及PMN变形能力低下等原因均有利于中性粒细胞在肝脏中聚集，该细胞在细胞因子、黏附分子等调控下，细胞在肝窦内滚动、黏附、渗出，并释放炎症因子、水解蛋白以及氧自由基等物质，导致肝窦内皮细胞损伤，进而加重肝脏损伤程度［16］。

综上，本研究认为梗阻性黄疸后血清HA的早期明显增高，可反映了肝脏内皮细胞功能的早期改变，而中性粒细胞在肝脏内大量聚集是导致梗阻性黄疸肝窦内皮细胞损伤，并致微循环障碍的主要原因。

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